一种获取剪切场下单个聚合物分子扩散以及定向运动信息的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种获取剪切场下单个聚合物分子扩散以及定向运动信息的方法，属 于高分子物理基础研究领域。
【背景技术】
[0002] 测量聚合物分子在其良溶剂中的扩散信息一直是高分子物理领域的重要基础性 研究工作。聚合物分子在其良溶剂中的扩散与其分子构象有着密切的联系，这方面的研究 不仅将帮助我们更好的理解聚合物溶液宏观性质的微观物理过程，也将帮助我们理解一些 生命过程的微观物理本质。
[0003] 扩散大体可以分为本体扩散和界面扩散或者二维受限扩散。对于本体扩散中国科 学院化学研究所韩志超等用激光动态光散射技术成功的得到了聚合物分子在半稀溶液中 的自扩散和协同扩散信息（Eric J.Amis, Charles C.Han.Cooperative and self-diffusion of polymers in semidilute solutions by dynamic light scattering， Polymer，1982,23:1403-1406)，George B.Benedek等人用去极化光散射技术成功的得到了 生物大分子在溶液中的旋转扩散信息（Stuart B.Dubin, Noel A .Clark and George B.Benedek.Measurement of the Rotational Diffusion Coefficient of Lysozyme by Depolarized Light Scattering:Configuration of Lysozyme in Solution， J.Chem.Phys.，1971，54:5158-5164);对于界面扩散或者二维受限扩散中国科学院化学研 究所赵江等用全内反射单分子荧光成像技术成功的测得了超薄膜体系结晶前后单个分子 链的扩音夂信息（Rui Chen,Lin Li and Jiang Zhao . Single Chain Diffusion of Poly (ethylene oxide)in Its Monolayers before and after Crystallization,Langmuir, 2010,26:5951-5956)。
[0004] 然而，全内反射单分子荧光成像技术对于慢扩散体系(凝胶、薄膜等)可以很好的 从单分子的角度获得其扩散信息，但是对于快扩散体系（聚合物稀溶液等)就丧失了活力； 光散射技术可以很好的得到中性聚合物分子的扩散信息，但是由于受到聚合物浓度以及散 射截面的限制，不适合多电荷体系的扩散的测量，因此不能够满足多电荷体系研究的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供获取剪切场下单个聚合物分子扩散以及定向运动信息的方 法，该方法既可以实施精确的动态剪切，而且具有单分子级别的分辨率和灵敏度，同时适用 于中性体系和多电荷体系。
[0006] 本发明提供的一种获取剪切场下单个聚合物分子扩散以及定向运动信息的方法， 包括如下步骤：
[0007] (1)配制浓度为1〇ηΜ以下的聚合物溶液，将荧光分子探针标记在聚合物分子上；
[0008] (2)在施加剪切场的同时，激光照射经标记的聚合物溶液，收集发射出的荧光信 号，即可得到单个聚合物分子扩散以及定向运动信息;所采用的测量系统包括:一用于作为 激发光照射待测样品的激发光源单元;一用于对待测样品施加机械剪切同时测量其宏观流 变学特性的剪切施加与流变测量单元，所述剪切施加与流变测量单元底部设置一激发光光 学窗口；以及一光学显微单元，所述光学显微单元用于将所述激发光源单元出射的激发光 经所述激发光光学窗口引入到位于剪切场下的待测样品，使得待测样品受激发产生荧光信 号，并将产生的荧光信号收集发射到一荧光关联光谱测量单元;所述荧光关联光谱测量单 元用于获取荧光信号，得到单个聚合物分子的扩散以及定向运动信息。
[0009] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述剪切施加与流变测量单元采用一转矩 流变仪，所述转矩流变仪下基板设置所述激发光光学窗口，所述激发光光学窗口具体可为 一石英载玻片，其厚度为〇. 13~0.17_，从而使光学窗口具有高透过率和短工作距离;在测 试过程中将待测的聚合物溶液滴加到该载玻片上测量，具体可滴加0.8~1.2mL(如lmL)，由 于聚合物溶液的浓度小于1〇ηΜ(如5nM)，微小的激发空间内平均存在单个或者少于单个荧 光分子，因此可得到单个聚合物分子的荧光关联光谱。
[0010] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述激发光源单元包括若干激光器、若干反 射镜、若干光阑、第一扩束镜和第二扩束镜，第二扩束镜的入射端可以设置一用于调节激发 光的功率的中性密度滤波片;所述激发光源单元可以采用连续激光或飞秒脉冲激光，目的 是激发更多种荧光分子，所选择激光器的波长需要与所激发的荧光探针相匹配;从所述激 光器发射的激光分别依次分别经若干反射镜反射或透射和所述光阑并依次经第一扩束镜 和第二扩束镜进行两级扩束将激光光束直径扩大到2.0cm左右以确保其尺寸大于光学显微 单元的显微镜物镜进光孔，从而获得充分利用物镜的数值孔径而产生最小的激发空间（达 10 一 15L 级别）。
[0011] 上述的测量方法中，所述测量系统中，所述测量系统中，所述光学显微单元采用倒 置焚光显微镜，包括一显微镜物镜、一二向色镜、一发射光高通滤波片、一激发光带通滤波 片、一针孔、一分束镜和一聚焦透镜，所述激发光经所述显微物镜发射到位于所述剪切施加 与流变测量单元内部的待测样品，经待测样品激发的荧光经所述显微物镜收集后发射到所 述二向色镜，经所述二向色镜出射的荧光信号经所述发射光高通滤波片和针孔发射到分束 镜，经分束镜出射的一部分光经所述聚焦透镜发射到所述荧光关联光谱测量单元;另外，所 述激发光源单元的出射端设置所述激发光带通滤波片。
[0012] 上述的测量方法中，所述测量系统中，为了有效消除探测器本身的after-pulsing 产生的假信号，所述测量系统还包括一第二荧光关联光谱测量单元、一反射镜和一聚焦透 镜，经所述分束镜出射的另一部分光经所述反射镜反射到所述聚焦透镜，经所述聚焦透镜 出射的光发射到所述第二荧光关联光谱测量单元。
[0013] 上述的测量方法中，所述测量系统中，荧光关联光谱测量单元均包括一单光子探 测器以和一数据采集卡，单光子探测器将探测接收的荧光信号转换为电信号经数据采集卡 发送到一计算机进行关联性分析以及关联函数的拟合，从而获得待测样品的扩散信息及定 向运动信息。
[0014] 上述的测量方法中，所述测量系统还包括一高精度位移平台，使用时可以将转矩 流变仪放置在显微镜物镜的上方，从而实现各个器件的精确联动。
[0015] 上述的测量方法中，所述荧光分子探针以化学键合的方式标记在所述聚合物分子 上，如聚合物分子链的末端。
[0016]上述测量方法中，所述聚合物可为DNA，具体可为人体单链DNA i-motif片段，序列 为5 '-CCCTAACCCTAACCCTAACCC-3 '。
[0017] 上述测量方法中，所述荧光分子探针可为荧光染料，具体可为Oregon Green 514， 其最大吸收波长为514nm，结构式如式I所示：
[0018]
[0019]上述的测量方法中，所述方法在所述标记之前还包括在所述DNA分子的5'端修饰 NH2-(CH2)6-的步骤，使得荧光分子探针中的琥珀酰亚胺酯键与DNA分子末端修饰的氨基反 应从而使荧光分子探针结合在DNA分子上。
[0020]上述的测量方法中，所述标记中，所述DNA与所述荧光染料的摩尔比为1: (3~7)， 具体可为1:5。