检测e种肠道病毒抗体的诊断抗原vp1及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术领域，具体涉及检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原及检测E种肠 道病毒抗体的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛肠道病毒(Bovine enterovirus, BEV)属于小RNA病毒科肠道病毒属中的成员， 分为E、F两个病毒种，所引起的感染给养牛业造成严重经济损失。本病自上世纪50年代首次 由Moll等报道以来，许多国家也相继报道了本病。申请人从吉林省多个地区暴发的临床上 以呼吸道和消化道症状为主要特征、发病率和致死率高达50%的牛群中分离鉴定出一种新 的肠道病毒-E种肠道病毒。E种肠道病毒感染在国内为新发传染病，严重威胁着养牛业的健 康发展，其诊断试剂、诊断方法和防治缺乏研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种检测E种肠道病毒抗体的诊断抗原。
[0004] 一种E种肠道病毒基因 VP1，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示； 所述的一种E种肠道病毒基因 VP1为人工合成。
[0005] -种E种肠道病毒蛋白VP1，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0006] -种用于检测动物血清中E种肠道病毒抗体的间接ELISA试剂盒，它的包被抗原 为氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示的蛋白VP1。
[0007] 本发明提供了一种E种肠道病毒基因 VP1，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所 示，表达的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示的蛋白VP1作为包被抗原制备的一种用于 检测动物血清中E种肠道病毒抗体的间接ELISA试剂盒，安全、灵敏度高、特异性强、操作 简便快速、成本低。
[0008] 本发明的优点 1、 具有生物安全性。试剂盒所用的E种肠道病毒VP1抗原为纯化的基因工程表达产物， 不含牛肠道病毒，不存在潜在散毒危险； 2、 灵敏度高、特异性强。通过免疫印迹技术，证实VP1蛋白、牛源高免血清具有良好的反 应原性、免疫原性，保证了该检测试剂盒的高度灵敏性。该试剂盒只检出E种肠道病毒抗体， 而牛病毒性腹泻、牛结核、牛口蹄疫、流行热阳性血清反应均呈阴性，表明该试剂盒具有特 异性； 3、 操作简便快速。试剂盒4 h即可报告结果，使用方便，一般技术人员按说明书即可操 作，条件一般实验室均可进行； 4、 成本低，投资少。该试剂盒成本在2-3元/头份，成本低，投资少，见效快。
【附图说明】
[0009] 图 1 PGEX-4T-1-VP1 重组质粒酶切鉴定（泳道 2、3:pGEX-4T-1-VPl;泳道l:pGEX- 41'-1质粒阴性对照;泳道4:0嫩分子11^·!^!·); 图2重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果(泳道3:pGEX-4T-1-VPl重组菌未诱导总蛋白； 泳道2:pGEX-4T-1-VPl重组菌诱导后总蛋白；泳道1:蛋白分子marker); 图3纯化重组VP1蛋白的SDS-PAGE检测结果； 图4试剂盒各组分（（1) 96孔抗体检测ELISA板，（2)样品稀释液，（3H0X浓缩洗涤 液，（4)封闭液，（5)HRP标记兔抗牛IgG工作液，（6)显色液A，（ 7)显色液B，（ 8)终止液，（9)阳 性样品对照，（10)阴性样品对照）。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 E种肠道病毒结构蛋白VP1原核表达重组质粒的构建 1、 引物设计 根据目标序列的碱基组成，分别设计引物扩增VP1基因的引物，上下游分别含有BamHI、 EcoR頂每切位点。引物序列如下： E-VP1-F CGCGGATCCGAAACAAGCGTGGAGA (BamHI) E-VP1-R CCGGAATTCGTACGAGGTGAGGCT (EcoRI) 2、 基因扩增 常规Trizol法提取E种肠道病毒的基因组RNA，采用市售常规反转录试剂盒，按照说明 操作获得cDNA，并以其为模板分别扩增了 VP1基因，PCR反应体系：
PCR 运行条件：94°C 预变性 2min;94°C 变性 lmin、54°C 退火 30sec、72°C 延伸 30sec，共 30 个循环;72°C再延伸5min。反应结束后，取lyL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测； 3、 目标基因与PGEX-4T-1的连接、转化 采用分子生物学领域中的常规酶切、连接等技术，构建重组质粒PGEX-4T-1-VP1，并采 用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态中。利用含1〇〇 yg/mL氨苄霉素的LB培养平 板筛选阳性克隆，并进行常规增菌培养，收获菌体，提取质粒，进行BamHI/EcoRI双酶切鉴 定，如图1所示。
[0011] 实施例2 VP1重组蛋白的表达及纯化 将鉴定的阳性重组质粒PGEX-4T-1-VP1转化BL21(DE3)感受态细胞后，挑取单个菌落 接种到3 mL含有100 yg/rnL氨苄霉素的LB液体培养基中培养过夜，然后取1 mL上述培养物 接种到200 mL含有100 yg/rnL氨苄霉素的LB液体培养基中37°C振摇培养至对数生长期 (0D_=0.6~0.8)，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，20°C诱导培养3 h，经SDS-PAGE检测，获得 了重组目标蛋白VP1，如图2所示。离心沉淀菌体，超声破碎后以尿素纯化包涵体方法获得高 纯度的重组蛋白，如图3所示。
[0012] 实施例3间接ELISA方法的建立及标准化 本发明以原核表达系统表达的VP1蛋白作为包被抗原，建立检测E种肠道病毒抗体的间 接EL ISA与诊断试剂盒，通过以下步骤实现。
[0013] 1、反应条件的建立 (1) 方阵确定抗原包被浓度及酶标二抗最佳稀释倍数 采用方阵滴定法，确定包被抗原和酶标二抗最佳工作浓度。将制备的重组VP1抗原进行 稀释，分别以〇. 2、0.3、0.4和0.5 yg/孔包被反应板，每个稀释度设8个重复孔，每孔100 yL， 同时设置8个空白对照孔，每孔加入100 yL包被液，置于4°C包被过夜。取出后用roS-T洗涤3 次，每次5 min。用5%脱脂奶粉37°C封闭30 min，洗涤同上。加入用PBS-T稀释800 X的阳性血 清及阴性血清样品，每孔1 〇〇 yL，37 °C作用30 min，洗涤同上。HRP标记羊抗牛IgG分别以 2000\、3000\和4000\稀释，37°(：作用60 1^11，洗涤同上。然后，向各孔加入新鲜配制的 OPD-H2〇2底物显色液50 yL，37°C避光显色10 min。最后每孔加入50 yL 2mol /L H2S〇4终止 液，轻轻混匀，在酶标仪上测定0D49Q值，计算出阴、阳性比值(P/N值），以P/N值最大所对应的 抗原浓度和HRP酶标二抗稀释度作为最优工作浓度。确定最佳抗原浓度为0.3 yg/孔，而最 佳酶标二