一组耐多药结核病诊断标志物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一组耐多药结核病诊断标志物及其用途。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)是引起结核病的病原菌，以侵 犯肺部引起肺结核为最多见，也可侵犯肺外其他组织引起全身多器官多部位结核。由于治 疗不当等原因，越来越多的结核分枝杆菌对主流抗结核药物产生了耐药性，尤其是耐多药 及广泛耐药结核分枝杆菌的出现和传播已成为全球结核病疫情回升的主要原因之一，是当 前世界结核病诊疗中的难题，给全球结核病防治工作带来了严峻挑战。耐多药结核病 (multidrug-resistant tuberculosis，MDR_TB，即结核分枝杆菌至少对利福平和异烟餅同 时耐药）的出现和传播，增加了结核病治疗的难度，所用的二线抗结核药物不仅毒副作用 大，费用昂贵，而且疗效远不如药物敏感的肺结核，成为当前世界结核病治疗中的一大难 题。更为严峻的是，广泛耐药结核病（extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB，即结核分枝杆菌在对利福平和异烟肼同时耐药基础上，也对氟喹喏酮类药物中任何一 种药物耐药，以及对3种二线抗结核注射药物硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少1 种具有耐药性的结核病）已悄然出现并正在持续扩散，目前该病几乎无药可治。因此，在结 核病疫情控制面临耐药结核病，尤其是耐多药结核病严峻挑战的今天，临床上急需高效、价 廉、易于推广的一种新的诊断耐药结核病的方法已迫在眉睫。目前关于用血清学技术诊断 耐多药结核病尚未见报道。
[0003] 目前诊断耐多药/广泛耐药结核病常用主要依靠细菌学和分子生物学方法检测有 无耐药相关基因的突变：1、传统培养法:操作繁琐且耗时长，从临床标本分离出结核分枝杆 菌的时间通常2 6周，不利于疾病的早发现及诊断；2、聚合酶链式反应-单链构想多态性分 析法(PCR-SSCP法）：其影响因素较多(DNA片段长度、凝胶浓度等），可重复性较差，在临床工 作中未得到广泛应用；3、RT-PCR法:对检测条件要求高，限制其推广;4、寡核苷酸探针杂交 法:是检测结核分枝杆菌的一种快速方法，但存在一定假阴性率和假阳性率，且试剂价格相 对昂贵，未得到临床推广;5、基因芯片法:具有时限短、所需样本少、热循环和冷却效率高等 优点，但因分析软件要求高，芯片的制作成本高等缺点限制其应用；6、GeneXp ert MTB/RIF 对肺结核痰涂阴病人及耐利福平结核菌的检测可以在2小时内完成，为肺结核快速诊断提 供便利，但在经济欠发达国家和地区，应用仍受限制。
[0004]总之，现有技术达不到快速、有效、价廉、便捷地诊断耐多药结核病。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一组耐多药结核病诊断标志物 及其用途，该组结核病诊断标志物来自结核分枝杆菌的8个抗原，判断被检人是否为耐多药 结核病，检测结果表明，本发明提供的蛋白质组合诊断耐多药结核病的最佳工作点的特异 性为80.4%，敏感性为80%，均高于现有技术中耐药结核病诊断的指标，且本技术为血清学 检测，标本容易获取，适用于各种可疑耐多药结核病，包括耐多药肺结核和肺外结核病的诊 断。
[0006] 其具体技术方案为：
[0007] 一组耐多药结核病诊断标志物，包括抗Rv0363cIgM抗体、抗Rv2396IgM抗体、抗 RvllOOIgM 抗体、抗 Rv3509cIgM 抗体、抗 Rv3653IgM 抗体、抗 Rv0350IgG 抗体、抗 Rv0865IgG 抗 体和抗Rv2031 cIgG抗体，其序列对应SEQ: ID: NO: 1 -SEQ: ID: N0:8。
[0008] 本发明所述耐多药结核病诊断标志物在筛选耐多药结核病诊断产品中的用途。
[0009] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0010]本发明通过商品化MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片筛选耐多药结核病诊断 分子标志物，该芯片涵盖>95%的编码基因，包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白。临床血清 样本包括正常对照组、活动性肺结核组以及耐多药结核病组，分别独立地与芯片反应，以检 测实验组中针对某一种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗结核抗体（IgG或IgM)。 基于初筛结果，选择差异较为明显的94个结核分枝杆菌蛋白质及本研究团队既通过双向凝 胶电泳技术分离获得的6个结核分枝杆菌差异表达蛋白质，自制含100个差异表达蛋白质小 芯片，送公司点片，每个蛋白重复两点点制，进行200余份血清样本的临床验证，最终获得8 个诊断耐多药结核病的候选标志物（Rv0363cIgM，Rv2396IgM，Rvl100 IgM，Rv3509cIgM， Rv3653IgM，Rv0350IgG，Rv0865IgG和Rv2031cIgG)。联合分析这8个蛋白质相应抗体的检测 结果，判断被检人是否为耐多药结核病，结果表明，本发明提供小芯片辅助诊断耐多药结核 病的最佳工作点的特异性为特异性80.4%，灵敏度80%，均高于现有技术中耐多药结核病 诊断的指标。
【附图说明】
[0011]图1为基于MtbProtTM蛋白质芯片的结核病诊断标志物的发现与筛选流程示意图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0013] 一、血清诊断标志物的发现与验证
[0014 ]( - )基于MtbPr 01TM蛋白质芯片的结核病诊断标志物的发现与筛选：
[0015] 1.检测原理:购买博柳生物公司MtbProtTM结核分枝杆菌蛋白质组芯片，该芯片包 含4262个结核分枝杆菌重组蛋白，涵盖>95%的编码基因。临床血清样本包括正常对照组、 活动性结核病药物敏感组，以及活动性结核病耐多药组，分别独立地与芯片反应，以检测实 验组中针对某一种或几种抗原蛋白，具有普遍性的特异性的抗结核抗体（IgG或IgM)，这些 抗原蛋白可以作为诊断标志物来表征疾病状态。
[0016] 2.实验操作人：由芯片服务组生产人员执行操作。
[0017] 3.流程图如图1所示。
[0018] 4.实验操作步骤：
[0019] 1)预封闭：使用芯片孵育盒(广州柳博公司自制），加入5ml封闭液，将待质控芯片 从-80°C取出，正面朝上置于孵育盒中；再横向放在侧摆摇床（国产）上，50-60rpm，室温， 10min〇
[0020] 2)封闭：倒弃封闭液，迅速加入5ml新的封闭液，侧摆摇床20-30rpm，室温lh。
[0021] 3)血清样本孵育：倒弃封闭液，迅速加入预先准备好的蛋白样本孵育液3ml，侧摆 摇床20-30rpm，室温3h。蛋白样本孵育液:3ml孵育液加入30μ1血清(新鲜制备或冻存于-80 度，由专利申请人提供）。
[0022] 4)清洗:将芯片取出，置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒，剧烈晃动10-15次，并 更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次，充分去除游离一抗;再次更换清洗液，至于水平摇床 上，60_70rpm，5min每次，清洗3次。
[0023] 5)二抗孵育：倒弃清洗液，迅速加入预先准备好的二抗孵育液3ml，侧摆摇床20- 30rpm，避光，室温45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG焚光二抗(549anti-人IgG，激发 光532nm，或635anti_人IgM，激发光635nm，Jackson ImmunoResearch)，孵育液稀释抗体至 其工作液浓度，总体积为3ml。二抗孵育时避光。
[0024] 6)清洗:同步