一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法
【技术领域】
[0001] -种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方 法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 进行同时检测。
【背景技术】
[0002] 食源性疾病通常指随着食物摄入人体的生物性、物理性、化学性有毒有害物导致 人体感染或中毒的疾病。食源性致病菌就是能引起食物中毒或感染的致病性细菌。鼠伤寒 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是最常见的引起食源性疾病的致病菌。鼠伤寒沙门氏菌是一种 需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，周身鞭毛，无荚膜，最适生长温度是34°C~37°C，最适pH 为7.0~7.8。沙门氏菌生长能力很强，且对环境的抵抗力强，甚至可以在低温、缺氧和干旱 条件下存活4个月。它是一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食 物经口进入人体后会随淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵 肠道后菌体裂解后会产生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中 毒症状。由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。金黄色葡萄 球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，最适生长温度是30°C~37 °C，最适pH为7.0~ 7.5,是葡萄球菌属中最重要的致病菌之一。由于金黄色葡萄球菌可在有氧或无氧的环境中 生长，高度耐盐、并且对温度(6.5°C~46°C)和pH(4.2~9.3)要求很低，因此能广泛的存在 于食品当中。金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌，可引起许多严重的感染，其致病机 制是侵袭人体后引起化脓性感染，通过分泌肠毒素等外毒素和酶类造成急性肠炎，引起呕 吐、腹泻等;或者菌体直接侵入人体，引起化脓性感染、肺炎、肠炎等。根据相关数据统计，金 黄色葡萄球菌在全球范围内为仅次于大肠杆菌第二常见的与食品中毒相关的病原体。
[0003] 目前，食源性致病菌的测定方法主要有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)、环介 导等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术（IFT)、胶 体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(MB)等。其中ELISA已被高度商业化，成为目 前食品安全、环境监测、医疗诊断中常用的检测方法，它结合了酶催化作用的高效性和抗原 抗体反应的特异性，达到快速灵敏检测的目的，但ELISA方法检测致病菌仍然需要足够数量 的细菌进行反应，因此在检测前需要进行预增菌培养阶段，此工序费力且耗时较长，限制了 其进一步应用。ELISA与GICA都是基于抗原抗体亲和反应，一抗体作为识别分子易受外界条 件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细胞实验，繁琐费时，成本较高，因此 检测成本也偏高。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型 检测方法很有必要。
[0004] 核酸适配体（Aptamer)通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一 簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具 有经济、简便、快速、适用范围广等特点。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白 和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相较，核算适配体有诸多优点，比 如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验;稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等， 而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全 中得到广泛应用。
[0005] 时间分辨焚光是一种特殊的焚光现象，是利用物质的焚光寿命长短进行时间分 辨，即采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度-时间曲线和在固 定时间的荧光发射光谱，用于对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分实现分辨并可分别进 行测定;通过设置合理的延迟时间(Delay time)和门控时间(Gate time，也称检测时间）消 除了检测环境中杂质自发荧光和背景荧光对信噪比的干扰，从而提高分析方法灵敏度。时 间分辨荧光分析技术发展的关键在于镧系元素荧光探针和分析模式的有效开发和结合利 用。随着纳米技术的蓬勃发展，具有良好水分散性的镧系纳米材料作为一类新型发光标记 物，其固有的时间分辨光学特性逐渐被开发并利用起来。镧系掺杂纳米材料本身具有诸多 优越的理化特性，比如水分散性好、荧光寿命长、耐光漂白，斯托克斯位移宽（~300nm)，生 物兼容性好，细胞毒性低，多色可调控(掺杂元素种类和比例），有利于生物体系中多组分同 时检测。鉴于上述优点，新型镧系掺杂的荧光纳米材料具备了良好的时间分辨荧光分析应 用前景。磁性纳米材料的物理长度恰好处于纳米量级且具有制备方法简单、原料低廉、独特 的超顺磁性、表面易于修饰、生物相容性好等特点，使得其在生物医学领域具有广阔的应用 前景。
[0006] 本发明构建了一种新颖的、灵敏的时间分辨荧光生物分析法同时检测鼠伤寒沙门 氏菌和金黄色葡萄球菌。首先合成了两种不同基质和掺杂不同镧系元素的具有时间分辨荧 光功能的纳米材料，该纳米材料可同时采用273nm的紫外光进行激发，并设定一定的门控时 间和延迟时间可分别在544nm和615nm处有非常强且窄的发射峰。对纳米材料表面进行亲和 素修饰，再将5 '端生物素化的目标寡核酸适配体链与亲和素化的纳米材料通过亲和素和生 物素的作用形成时间分辨荧光探针。采用类似的方法用目标适配体修饰磁性材料作为捕获 探针。由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时 间分辨荧光纳米材料"三明治"夹心复合物。在酶标仪的时间分辨荧光模式下，以273nm进行 激发，记录544nm和615nm处焚光信号强度，通过对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡 萄球菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌样品进行定量 检测的目的。该发明可以用于禽畜肉类、饮品类、牛奶及乳制品等样品中鼠伤寒沙门氏菌和 金黄色葡萄球菌含量的检测。
【发明内容】
[0007] 一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方 法:分别制备得到NaYF4: Ce/Tb，NaGdF4: Eu时间分辨荧光纳米材料和Fe3〇4磁性纳米材料，对 时间焚光分辨纳米材料和磁性纳米材料进行表面功能化修饰并与亲和素(Avidin)偶联，随 后通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的作用与生物素(Biotin)修饰的适配体DNA 特异性结合分别构成荧光探针和捕获探针。适配体固定到磁性纳米材料表面，用于捕获和 富集鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，NaYF4: Ce/Tb和NaGdF4:Eu分别标记鼠伤寒沙门氏 菌和金黄色葡萄球菌，加入目标菌进行孵育，由于是适配体对目标菌体的特异性识别，最 终形成磁性材料-适配体-菌体-适配体-时间分辨荧光纳米材料复合物。采用酶标仪在时间 分辨焚光的模式下，用273nm的激发光，并设定延迟时间为lOOys，检测时间为lOOOys，可分 别在544nm和615nm得到Tb和Eu的特异性发射峰，并且在一定范围内鼠伤寒沙门氏菌和金黄 色葡萄球菌的含量与荧光强度的数值相关，基于此对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌标准品进 行检测，建立标准曲线，已达到对实际样品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行定量检测的 目的。步骤为：
[0008] 1、采用一步溶剂热法合成NaYF4:Ce/Tb和NaGdF4:Eu，并对其做表面修饰
[0009] 制备NaYF4:Ce/Tb:称取lmmol的磷酸乙醇胺(AEP)和lmmol的NaCl溶于30ml乙二醇 中并不断搅拌，随后加入〇.9mmol Y(N〇3)3*6H2〇、0.05mmol Ce(N03)3*6H2〇、0.05mmol Tb (Nods · 6H20。然后，将含有4mmol NH4F的10ml乙二醇溶液(45°C水浴搅拌充分溶解)逐滴加 入上述透明溶液中，于室温下继续搅拌30min后转移至50ml铁氟龙高压反应釜内，195°C反 应4h。反应后，取出冷却至室温，以乙醇、超纯水交替洗涤三次，溶于超纯水中于4°C冰箱保 存备用。制备NaGdF4:Eu:将2.0mmol NaCl、1.0mmol GdCl3*XH2〇和O.lmmol EuC13*6H20溶 于以及lml聚乙烯亚胺（PEI)水溶液加入20ml乙二醇中室温下搅拌。然后，将含有6mmol NH 4F的10ml乙二醇溶液(45 °C水浴搅拌充分溶解)逐滴加入上述透明溶液中，于室温下继续 搅拌30min后转移至50ml铁氟龙高压反应釜内