使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法

使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食品、保健食品、药品或其原材料中的氨基葡萄糖及其类似物的 含量测定方法。特别是涉及一种采用分光光度计测定食品、保健食品、药品或其原材料中的 氨基葡萄糖及其类似物的含量测定方法。
【背景技术】
[0002] 氨基葡萄糖是一种可以人体内合成的物质，是形成软骨细胞的重要营养素，是健 康关节软骨的天然组织成份，亦是软骨细胞进行生物合成与代谢必不可少的底物。随着年 龄的增长，人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重，以致引发骨关节疾病和骨关节炎。大量 医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长，改善关节 活动，缓解关节疼痛。它对治疗风湿性关节炎症有良好的疗效，是合成抗生素和抗癌药物的 主要原料，还可应用于食品，化妆品和饲料添加剂中。
[0003] 目前常用的氨基葡萄糖含量检测方法有：紫外-可见分光光度法、高效液相色谱 法、高效阴离子色谱法、气相色谱法、滴定法、液相色谱质谱联用法。当保健食品及药品中复 配组分较多时，上述方法具有多种瓶颈问题，如操作复杂、影响因素多、专属性不强、灵敏度 低、或不易推广等。
[0004] 随着氨基葡萄糖在保健食品及药品中越来越广泛的应用，建立一套快速，灵敏，简 便，准确的分析方法迫在眉睫。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于解决现有氨基葡萄糖测定方法存在的操作复杂、专属性差、和/ 或灵敏度低等缺陷，提供一种可见分光光度法测定原料、食品、保健食品或药品中氨基葡萄 糖中的氨基葡萄糖或其类似物的含量的分析方法，并且期待该方法快速、灵敏、简便、和/或 准确。已经出人意料地发现，使用本发明方法能够有效地实现上述一个或多个目的。本发明 基于此发现而得以完成。
[0006] 为此，本发明第一方面提供了一种测定制品中的氨基葡萄糖或其类似物含量的方 法，该方法使用分光光度法进行测定，包括如下步骤：
[0007] (1)标准氨基葡萄糖储备液的制备:取盐酸氨基葡萄糖对照品l-200mg，精密称定， 置于25ml容量瓶中，用pH2-10缓冲溶液稀释并定容至刻度作为对照品储备液（需要说明的 是，使用盐酸氨基葡萄糖配制的对照品溶液可以用于测定其它形式的氨基葡萄糖例如用于 测定硫酸氨基葡萄糖，只要在最后计算时作简单的换算即可）；
[0008] (2)样品溶液的制备：取相当于0.1 -250mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于 100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液 作为供试品溶液；
[0009] (3)标准对照品及供试品显色及测定:精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色 管中，加入0.5%-10%的茚三酮溶液0.5-10ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混 匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入Ο . 5 % -10 %的茚三酮溶液Ο . 5-l〇ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；将对照品及供试品待显色溶液置于70-100°C水浴中显色10-100min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至 25ml，混匀;采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸 光度进行测定；
[0010] (4)根据对照品溶液和供试品溶液的吸光度以及对照品溶液浓度计算所述制品中 的氨基葡萄糖或其类似物的含量。
[0011]根据本发明第一方面的方法，其中所述制品选自：包含氨基葡萄糖或其类似物的 食品、保健食品、药品，或者制备它们的氨基葡萄糖或其类似物原料。
[0012] 根据本发明第一方面的方法，其中所述氨基葡萄糖类似物选自：盐酸氨基葡萄糖、 硫酸氨基葡萄糖、氨基葡萄糖硫酸钾盐、氨基葡萄糖枸橼酸钙等氨基葡萄糖有机酸盐及氨 基葡萄糖无机酸盐等。
[0013] 根据本发明第一方面的方法，其中步骤（1)中，取盐酸氨基葡萄糖对照品20-50mg， 精密称定，置于25ml容量瓶中，配制对照品储备液。
[0014] 根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液是pH6-8的缓冲溶液。
[0015] 根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液是采用酸，碱及盐配制的不同pH 值缓冲溶液，其中酸包括盐酸，柠檬酸，甲酸，乙酸等，碱包括氢氧化钠，氢氧化钾等，盐包 括，氯化钠，柠檬酸钠，甲酸钠，乙酸钠等，PH2-10缓冲溶液也可为以上所提到的酸、碱、盐的 单溶液。根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液选自：柠檬酸钠溶液、乙酸钠溶液、 甲酸钠溶液等。所述缓冲溶液的浓度是〇. 1~〇. 5mol/L，例如其浓度是0.1~0.3mol/L，例如 其浓度是〇.2mol/L。
[0016] 根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所取的供试品中精密称取相当于含 50-150mg氨基葡萄糖的供试品，以用于制备供试品溶液。
[0017] 根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中还包括采用分光光度计在200-800nm 波长范围内对显色后的对照品溶液进行扫描以确定其最大吸收波长。
[0018] 根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中对照品溶液及供试品溶液在氨基葡 萄糖的最大吸收波长处测定吸光度。
[0019] 根据本发明第一方面的方法，其中采用分光光度计在560~570nm波长下对显色后 的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。根据本发明第一方面的方法，其中采用分 光光度计在565nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。
[0020] 根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，分别精密量取对照品储备液和供试 品溶液各〇. 5~lml置于25ml比色管中，以进行显色反应。
[0021 ]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，茚三酮溶液浓度为1 %~5%。
[0022]根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，每支比色管中的茚三酮溶液的添加 量为0 · 5~2ml，例如lml。
[0023]根据本发明第一方面的方法，其中步骤（3)中，在添加茚三酮溶液后，再加入5-l〇ml缓冲溶液，接着进行加热显色反应。
[0024]根据本发明第一方面的方法，其中步骤（3)中，在热水浴中显色反应处理50~ 100min〇
[0025] 已经发现，本发明下文实施例1-7中所检测的制品或对照品试验，均获得了令人满 意的结果。需要说明的是，在本发明步骤(3)经水浴加热处理并用缓冲溶液定容后，至分光 光度法测定之前(这一时间段在本文中可以表示为T，定容后即刻进行测定时T表示为0小 时），都能够并且均是在1小时之内完成的。但是，已经发现，这些实施例1-7中所检测全部供 试品或对照品溶液，在T大于1小时候后，特别是大于2小时候后，其吸光度值会有明显的降 低。具体地讲，实施例1-7中所检测全部测试液，对于同一测试液，在T=1小时时各测试液吸 光度值相当于相应测定液在T = 0小时时的98~101 %，在T = 2小时时各测试液吸光度值相 当于相应测定液在Τ = 0小时时的95~97 %，在Τ = 3小时时各测试液吸光度值相当于相应测 定液在Τ = 0小时时的93~96%，在Τ = 5小时时各测试液吸光度值相当于相应测定液在Τ = 0 小时时的90~93%;例如对于实施例1的供试品溶液和对照品溶液，其在Τ = 3小时时吸光度 值分别相当于相应测定液在Τ = 0小时时的94.7%和95.2%。这表明，尽管通常能够在1小时 之内完成测试任务，但是这种方法学缺陷仍然是期待克服的。本发明人在补充的试验中发 现，当在重复进行实施例1-7的全部试验时，向所用缓冲溶液中额外添加0.15% (w/v)酒石 酸氢钾时，可以完全克服上述问题，并