一种用高效液相色谱仪检测牛磺熊去氧胆酸中杂质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物质量测定方法技术领域，尤其涉及一种用高效液相色谱仪检测牛 磺熊去氧胆酸中杂质的方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic Acid)化学名称为3α，7β二羟基胆烧酰-Ν-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的梭基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸， 为白色或类白色粉末。在乙醇、甲醇易溶，冰醋酸中溶解，水中略溶，乙腈、乙酸乙酯、丙酮、 四氢呋喃中不溶。可增加胆汁酸的分泌，导致胆汁酸成分的变化，使其在胆汁中的含量增 加。牛磺熊去氧胆酸还可抑制肝脏胆固醇的合成，降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯的量和胆 固醇的饱和指数，从而有利于胆汁中胆固醇逐渐溶解。
[0004] 牛磺熊去氧胆酸有这么多的功效，被大量使用。但在制备过程不免会有各样杂质 没有去除，使产品达不到规定，或给疗效上带来新的问题。
[0005] 在各样杂质中，熊去氧胆酸杂质、中间体、牛磺鹅去氧胆酸杂质、牛磺海狸鼠胆酸 和对硝基苯酚杂质为主要杂质，需要对它们进行检测，并去除。
[0006] 目前有人用高效液相色谱法监控杂质，高效液相色谱法又称〃高压液相色谱〃、〃高 速液相色谱〃、〃高分离度液相色谱〃、〃近代柱色谱〃等。高效液相色谱是色谱法的一个重要 分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合 溶剂、缓冲液等流动相栗入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行 检测，从而实现对试样的分析。
[0007] 比如中国专利CN201010552339.4说明书中，提到的杂质分析方法为国家标准的色 谱方法，但运用此方法不能够将相关杂质全部进行分离开。中国专利201010577534.2说明 书中，也提供了一种超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，但也存 在着只能检测出单一的杂质。还有相关文献中提到"RP-HPLC法测定熊去氧胆酸中的有关物 质"，此方法同样无法将需要监控的杂质全部分离开；国内外法定药典均没有收载此产品的 杂质色谱条件;而国家标准提供的现有色谱条件仅能够监控牛磺鹅去氧胆酸杂质，其他需 要监控的杂质无法在此色谱条件下进行监控，而是采用了非定量的薄层色谱法(TLC)进行 补充，比如牛磺酸、熊去氧胆酸、其他未知杂质等。但因这些色谱条件的技术缺陷，无法满足 对产品的高品质的要求，而且多个杂质监控方法使质量监控人员工作量增加，不能够及时 的监控产品中的全部杂质，与生产监控要求的及时性、准确性等相差甚远。
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【发明内容】
[0009]为了解决以上技术问题，本发明提供一种用高效液相色谱仪检测牛磺熊去氧胆酸 中杂质的方法，能够在同样的色谱条件下，全面检测牛磺熊去氧胆酸中杂质，保障产品的品 质;操作简单，时间快，精确度高，数据稳定，成本降低。
[0010] 解决以上技术问题的本发明中的一种用高效液相色谱仪检测牛磺熊去氧胆酸中 杂质的方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 试样溶液准备： 杂质贮备液:称取熊去氧胆酸l〇mg、牛磺鹅去氧胆酸10mg、中间体10mg、牛磺海狸鼠胆 酸1 Omg、对硝基苯酚1 Omg，分别置50mg量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液； 主成分溶液:牛磺熊去氧胆酸和乙腈溶液； 稀释溶剂:体积百分比为5%的乙腈水溶液5-lOOml; 流动相A:磷酸缓冲盐； 流动相B:乙腈； (2) 制备供试品溶液： 取牛磺熊去氧胆酸50mg置5ml量瓶中，加5%乙腈溶解并稀释至刻度； (3) 制备对照品溶液： 精密量取熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、中间体、牛磺海狸鼠胆酸、对硝基苯酚杂质贮 备液各5ml置100ml量瓶中，用5%乙腈溶液稀释至刻度。
[0011] (4)杂质分离及限度要求： 用高效液相色谱仪对对照品溶液进行色谱定位，各杂质之间的分离度> 1.5;在同一色 谱系统洗脱出来记录的色谱图中每个杂质与杂质之间的分离度要大于1.5;主成分峰理论 塔板数不得低于2000;主成分峰拖尾因子不得过2.0,主成分峰的保留时间应在8-12min内。 [0012]检测结果中，若熊去氧胆酸杂质< 0.1%;牛磺鹅去氧胆酸< 0.1%，牛磺海狸鼠胆酸 < 0.1%、对硝基苯酚< 0.1%，中间体< 0.1%，则为合格质量的产品。
[0013] 本发明中以下几个条件需要同时满足： 本发明中杂质的含量确定是采用色谱方法中的"加校正因子的主成分自身对照法"来 确定。
[0014] 所述磷酸缓冲盐为0.02mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH至3.0。
[0015] 所述乙腈为分析纯乙腈。
[0016] 本发明中用梯度洗脱法来设计色谱条件，使在同一个色谱条件下分离这些杂质。
[0017] 所述高效液相色谱仪色谱条件为：色谱柱:C18柱，柱温25-35°C，流速0.8-1.2ml/ 111；[11，检测波长21011111。
[0018]优化方案中所述高效液相色谱仪色谱条件为:色谱柱:C18柱，柱温30°C，流速lml/ 111；[11，检测波长21011111。
[0019] 本发明中色谱条件是根据牛磺熊去氧胆酸主成分性质及各杂质在色谱洗脱条件 下，主成分中杂质色谱分离情况来确定。确定的色谱条件可以全面监控牛磺熊去氧胆酸杂 质的残留情况，给合成车间工业化化生产监控产品品质提供可行的检测条件。
[0020] 所述高效液相色谱仪色谱检测中采用梯度法，其梯度表如下： T(min) 0 10-15 30-40 40-50 55 60 A相（％):80 30-55 30-55 30-55 20 80 B相（％):20 45-60 60-70 60-70 20 20 进一步优化方案中梯度法程序的梯度表如下： T(min) Ο 15 30 50 55 60 流动性A相（％) :80 40 30 30 20 80 流动性B相(％) :20 60 70 70 20 20 牛磺熊去氧胆酸主成分紫外吸收较弱，都是紫外末端吸收，而且极性较大，若采用高效 液相等度色谱一般方法中的条件无法将众多的杂质进行分离和准确定量，一般方法是用需 要采用其他监控手段比如TLC技术来进行补充监控。补充监控的加入，可以一定范围内检测 准确，但依然存在对产品的杂质漏检，而且无法精确定量分析，导致合成工业化生产时，无 法全面监控杂质，给产品品质带来隐患。
[0021] 梯度法具体操作就是按已设计好的梯度运行时间表，在高液设备自带的梯度洗脱 设置软件上输入运行时间，高液根据时间运行要求自行切换流动性的洗脱比例，达到将不 同极性的杂质在同一根色谱柱中依次洗脱出来，而且时间短，杂质监控全面，除了能够监控 这些已知杂质外，梯度洗脱程序还可以洗脱出其他未知的杂质，达到全面控制产品品质的 目的。
[0022] 本发明中的检测方法能够在同样的色谱条件下，全面检测牛磺熊去氧胆酸中杂 质，保障产品的品质；同时此色谱条件的运用，可以监控制剂产品中的杂质降解情况，给产 品的生产、贮藏、运输、临床使用提供了科学的监控质量色谱体系。
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【具体实施方式】
[0024] 以下通过实例对本发明作进一步的说明： 其中，本品化学名称为2-[[(3α, 5β, 7β)_3, 7_二羟基_24_氧代胆留烧_24_基]氛基] 乙烷磺酸二水合物。
[0025] 所用仪器或设备、相应的剂型： 高液色谱设备:Agilent 1200 四元栗(G1311A)，Agilent 1200DAD 检测器(G1315A)， Agilent 1200真空脱气机，（G1322A)Agilent 1200自动进样器（G1367A)，D〇-chrom(DT-230A)柱温箱 色谱柱:Ci8(型号：Sapphire，长:250mm，内径:4 · 6mm，填料粒径:5??m ) 试剂：乙腈(天津科密化学试剂有限公司，1298156,色谱级），磷酸二氢钾(成都科龙化 学试剂有限公司，120011，AR级），磷酸(成都科龙化学试剂有限公司，128011，AR级） 天平：METTLER TOLEDO XS105 实施例1 用高效液相色谱仪检测牛磺熊去氧胆酸中杂质的方法，包括以下步骤： (1)试样溶液准备： 杂质贮备液:称取熊去氧胆酸l〇mg、牛磺鹅去氧胆酸10mg、中间体10mg、牛磺海狸鼠胆 酸1 Omg、对硝基苯酚1 Omg，分别置50mg量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液； 主成分溶液:牛磺熊去氧胆酸和乙腈溶液； 稀释溶剂:体积百分比为5%的乙腈水溶液5-100ml; 流动相A:磷酸缓冲盐，具体为0.02mo