草木犀药材的uplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及草木犀药材的超高效液相色谱（UPLC) 指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
【背景技术】
[0002] 草木犀·又写作草木禪，为?科草木犀·属（Melilotus Miller)，一年生或二年生草 本植物。草木犀常见生于沙丘、山坡、草原、海边，分布于我国大部分省区，又名辟汉草、省头 草、野苜蓿及铁扫把。目前在我国栽培的多为白花草木犀和黄花草木犀。黄花草木犀由于 其自身的生长优势和化学成分适宜，在中国被用作很好的香料原料。草木犀可以以全草入 药，民间以叶、花制成软膏，用作外用药，或煎服用于治疗浮肿、腹痛、疟疾等症。
[0003] 由于草木犀的生长地域差异，所以作为中药材使用的草木犀存在质量控制不稳 定、并且难以进行定性和定量分析等问题。中药指纹图谱是指中药样本经光谱或色谱等现 代分析技术得到的中药各组分群体的特征图谱，目前已成为国内外公认的鉴别中药品种和 评价中药质量的最有效手段之一。目前最新的指纹图谱测试方法之一是超高效液相色谱 (Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)，这是最近几年出现的一种新型液相 色谱技术，采用1. 7 μ m的小粒径色谱柱填料，不仅使柱效得以提高，而且在较宽的流速范 围内柱效保持恒定，从而有利于通过提高流动相的流速而缩短分析时间，提高分析通量。相 对于常规HPLC(高效液相色谱，High Performance Liquid Chromatography)而言，UPLC有 更好的分离效率、峰容量以及灵敏度。但是，在草木犀药材分析技术领域，还仍未有用UPLC 对草木犀药材进行质量控制分析以及报道其指纹图谱。
[0004] 因此，本发明提供一种首次利用UPLC技术，对草木犀药材指纹图谱进行研究，为 草木犀药材质量控制提供了新的技术方法。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种草木犀药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法，以及由此方 法得到的草木犀药材标准指纹图谱及其在草木犀药材优化筛选、品质的鉴别和控制中的应 用。根据本发明的构建方法解决了草木犀药材的成分分析中不能有效地反映和控制草木犀 药材的整体质量的问题，弥补了现有质量控制技术的不足。
[0006] 根据本发明的一个方面，提供一种草木犀药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建 方法，包括：
[0007] (1)制备草木犀药材的多个供试样品溶液及香豆素对照样品溶液；
[0008] (2)将步骤（1)所制备的供试样品溶液及对照样品溶液分别进行超高效液相色谱 分析，得到超高效液相色谱图；
[0009] (3)以对照样品溶液的超高效液相色谱图作为对照，从步骤（2)所得到的供试样 品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征峰构建草木犀的标准指纹图谱，
[0010] 所述步骤（2)中超高效液相色谱分析的条件为：
[0011] 采用反相填料色谱柱，用流动相乙腈-〇. 05~0. 2体积％磷酸或醋酸水溶液进行 梯度洗脱，紫外检测波长为220~277nm。
[0012] 在本发明的一个优选实施方式中，所述步骤（1)制备草木犀药材的供试样品溶液 及香豆素对照样品溶液的方法包括用30~70体积％的甲醇水溶液处理；优选地，所述甲醇 水溶液为50体积％的甲醇水溶液。
[0013] 在本发明的另一优选实施方式中，本发明中所使用的反相填料色谱柱为Waters Acquity UPLC? BEH C18,该色谱柱尺寸为50mm X 2. 1mm，填料颗粒度为1. 7 μ m。
[0014] 在本发明的另一优选实施方式中，梯度洗脱程序为：0min - 1. 5min - 3. 5~ 4. Omin - 5. Omin，乙臆5~10体积％ - 13~22体积％ - 13~22体积％ - 5~10体 积％ ;优选地，梯度洗脱程序为乙腈5体积％ - 13~15体积％ - 13~15体积％ - 5体 积％ ;更优选地，梯度洗脱程序为Omin - 1. 5min - 4. Omin - 5. Omin，乙腈5体积13 体积％ - 13体积％ - 5体积％。
[0015] 在本发明的另一优选实施方式中，流动相的流速为0. 3~0. 7mL/min，柱温在25~ 40°C范围内；优选地，流速为0. 6~0. 7mL/min，柱温为30°C。
[0016] 在本发明的另一优选实施方式中，步骤（2)中超高效液相色谱分析的条件为：所 述流动相为乙腈-ο. 1体积％磷酸水溶液，流速为〇. 6mL/min，波长为277nm，柱温为30°C。
[0017] 根据本发明的另一个方面，提供一种草木犀药材标准指纹图谱，其通过本发明的 上述草木犀药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法获得的。
[0018] 优选地，本发明的草木犀药材的标准指纹图谱为超高效液相色谱UPLC的指 纹图谱，并且包含14个共有特征峰，以12号峰香豆素为参照峰，其相对保留时间分 别为：0.062(±5 % )、0.080(±5 % )、0· 102(±5 % )、0.345(±5 % )、0.445(±5 % )、 0.669(±5 %)、0.686(±5 %)、0.713(±5 %)、0.801(±5 %)、0.866(±5 %)、 0.912(±5% )、1.000(±5% )、1.036(±5% )和 1. 101(±5% )。
[0019] 其中，上述14个共有特征峰中，峰10为草木犀酸；峰12为香豆素；峰14为邻香豆 酸。
[0020] 优选地，本发明的草木犀药材的标准指纹图谱为超高效液相色谱UPLC的指纹图 谱，在紫外检测波长220nm时得到的供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择共有特征 峰构建了 UPLC标准指纹图谱，包括16个共有特征峰，以14号峰香豆素为参照峰，其相 对保留时间分别为：峰 1 :〇. 〇62(±5% )、峰 2 :0. 080(±5% )、峰 3 :0. 093(±5% )、峰 4 :0· 383(±5 % )、峰 5 :0· 445(±5 % )、峰 6 :0· 607(±5 % )、峰 7 :0· 669(±5 % )、峰 8 : 0. 686 (±5% )、峰 9 :0.713 (±5% )、峰 10 :0.747 (±5% )、峰 11 :0.801 (±5% )、峰 12 : 0· 866(±5% )、峰 13 :0· 912(±5% )、峰 14 :1· 000(±5% )、峰 15 :1· 036(±5% )和峰 16 : 1. 101(±5% )。
[0021] 其中，上述16个共有特征峰中，峰12为草木犀酸、峰14为香豆素、峰16为邻香豆 酸。
[0022] 优选地，本发明的草木犀药材的标准指纹图谱为超高效液相色谱UPLC的指纹图 谱，在紫外检测波长275nm时得到的供试样品溶液的超高效液相色谱图中选择了共有特 征峰构建了 UPLC标准指纹图谱，包括15个共有特征峰，以13号峰香豆素为参照峰，其相 对保留时间分别为：峰 1 :〇. 〇62(±5% )、峰 2 :0. 080(±5% )、峰 3 :0. 337(±5% )、峰 4 :0· 446(±5 % )、峰 5 :0· 475(±5 % )、峰 6 :0· 617(±5 % )、峰 7 :0· 679(±5 % )、峰 8 : 0.700 (±5% )、峰 9 :0.723 (±5% )、峰 10 :0.772 (±5% )、峰 11 :0.813 (±5% )、峰 12 : 0· 865(±5% )、峰 13 :1· 000(±5% )、峰 14 :1· 030(±5% )、峰 15 :1· 087(±5% )。
[0023] 其中，上述15个共有特征峰中，峰12为草木犀酸、峰13为香豆素、峰15为邻香豆 酸。
[0024] 根据本发明的再一个方面，提供上述草木犀药材的标准指纹图谱在草木犀药材以 及含草木犀药材的制剂的检测中的应用。
[0025] 根据本发明的再一个方面，提供一种检测草木犀药材的方法，其中，所述方法包括 将待测草木犀药材的指纹图谱与本发明上述草木犀药材的标准指纹图谱相比较。
[0026] 根据本发明的草木犀药材的超高效液相色谱指纹图谱的构建方法或者获得的标 准指纹图谱与现有技术相比具有下述显著的优点：
[0027] (1)本发明首次利用UPLC技术，对草木犀药材进行指纹图谱研究，为草木犀药材 质量控制提供了新的分析方法。
[0028] (2)将草木犀药材作为整体对待，通过比较其共有峰，可以找出不同药材之间的细 微差异，适用于草木犀药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
[0029] (3)本发明供试样品制作简单，色谱条件容易实现，精密度高，而且其稳定性和重 现性较好，本发明采用的检测波长出峰较多，反映的信息完全。
[0030] (4)与传统HPLC方法相比较，在不影响整体效果的前提下，大大缩短了在线分析 时间，节省了材料成本和时间成本。
【附图说明】
[0031] 图1是根据本发明实施例1获得的草木犀药材的标准UPLC指纹图谱。
[0032] 图2是根据本发明实施例1构建的10批次草木犀药材的UPLC指纹图谱（S1-S10) 与标准UPLC指纹图谱（R)的对比图。
[0033] 图3是香豆素对照样品的UPLC指纹图谱
[0034] 图4是根据本发明实施例2获得的草木犀药材的标准UPLC指纹图谱。
[0035] 图5是根据本发明实施例2构建的10批次草木犀药材的UPLC指纹图谱（S1-S10) 与标准UPLC指纹图谱（R)的对比图。
[0036] 图6是根据本发明实施例3获得的草木犀药材的标准UPLC指纹图谱。
[0037] 图7是根据本发明实施例3构建的10批次草木犀药材的UPLC指纹图谱（S1-S10) 与标准UPLC指纹图谱（R