一种叶面锌肥肥效的原位评价方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及叶面肥肥效评价技术，具体涉及一种叶面锌肥肥效的原位评价方法。
【背景技术】
[0002]锌是动植物和人体必需的微量营养元素，直接或间接参与生命体内的代谢过程，在生命活动中起着极其重要的作用，被誉为“生命之花”、“智慧元素”。然而，我国缺锌状况十分严重，土壤缺锌面积高达40%，严重影响了作物产量与品质，直接或间接导致了人体对锌的摄入不足，成为威胁人类健康尤其是儿童智力发育的重要限制因子。在解决人类对微量元素需求的途径中，粮食作物微量元素的生物强化被认为是最有前景的途径之一，因此，通过农艺措施改善作物锌营养状况，对提高作物生产力和保障人体健康均具有非常重要的现实意义。
[0003]叶面施肥是公认的实现微量元素生物强化目标最直接、高效的农艺措施之一，叶面锌肥可以有效弥补土壤施锌肥存在的易被土壤吸附固定、淋失、施用不均等局限性，补充作物锌素营养、矫正作物缺锌症，提高作物产量品质。作为土壤施肥的辅助措施，叶面肥已成为农业生产中施用微量元素肥料的主导技术，显示出明显的效能优势和应用前景。
[0004]然而，叶面施锌普遍存在着吸收难、转运慢的问题，严重影响了叶面施锌的作用效果和施用效率。叶面喷施的养分从叶表面渗透到叶片内部后，其营养功效和生理有效性不仅取决于植物叶片细胞对养分的吸收利用，还与养分向其他部位的转运与再利用能力相关。但是，迄今关于叶面喷施的锌在植物叶片内部如何被吸收利用、储存与再转运等关键机理仍知之甚少，如何促进锌从叶片喷施部位向其他部位的转运仍然是叶面锌肥及其施用技术研发中的瓶颈。
[0005]可见，全面了解和阐明叶面锌肥作用机理，不仅能为研发新型叶面锌肥及其促效技术提供理论依据，而且是提高叶面锌肥施用效率的关键所在。然而，长期以来，叶面喷施的锌在植物体内的追踪和定位技术未能突破。传统评价叶面肥的肥效技术，通常采用长期定位试验方法，结合破坏性采样等分析测试手段，费时长、见效慢，且由于易产生污染而常导致评价结果出现较大的偏差。同位素标记技术，虽可在一定程度上追踪叶面喷施后锌在植物中的吸收和转运特征，但难以对进入到植物组织内部的锌进行细胞与亚细胞定位，不能原位解析锌在植物体内的吸收、运输与再转运机制。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种叶面锌肥肥效的原位评价方法，利用该方法能够简便高效地追踪叶面喷施后，锌在植物中的吸收和转运特征，实现叶面锌肥肥效的快速原位评价。
[0007]本发明所提供的技术方案为:
[0008]—种叶面锌肥肥效的原位评价方法，包括如下步骤:
[0009]I)配制同位素68Zn标记液；
[0010]2)选取实验植株中的待标记叶片，对待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液；
[0011]3)选定步骤2)中实验植株的待测部位，所述的待测部位与特定部位没有重合区域，对待测部位进行前置处理；
[0012]4)对步骤3)中经过前置处理的待测部位进行μ-XRF原位分析、LA-1CPMS验证分析、ICP-MS定量分析中的两种或三种。
[0013]作为改进，所述的待标记叶片优选成熟叶片;所述的待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液前，用去离子水清洗待标记叶片的上表皮和下表皮。
[0014]作为进一步改进，在所述的待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液前，在所述的待测部位用羊毛脂(Lanolin)涂抹并用Teflon膜包裹，避免待测部位受到同位素68Zn标记液的污染。
[0015]作为改进，所述的特定部位的同位素68Zn标记液的标记是通过粘贴含同位素68Zn标记液的滤纸或浸泡在同位素68Zn标记液中的两种方式对特定部位进行标记。
[0016]作为优选，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的整个叶面，所述的步骤3)中待测部位为待标记叶片的叶柄以及实验植株新生的新叶。
[0017]作为进一步优选，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指:将所述的待标记叶片的叶柄进行冷冻切片，然后冷冻干燥；另外分别将待标记叶片的叶柄和实验植株新生的新叶烘干磨碎，进行三酸消煮。
[0018]作为优选，所述的烘干磨碎，烘干温度为60?70°C，时间为60?80h。
[0019]作为优选，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的局部叶面，所述的步骤3)中待测部位为待标记叶片的剩余叶面。
[0020]作为进一步优选，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指:将所述的待标记叶片的剩余叶面进行冷冻干燥。所述的冷冻干燥的温度为-85?-75°C，时间为60?80h。[0021 ]作为优选，所述的步骤I)中同位素68Zn标记液包括150?250mg L—1的ZnSO4水溶液，所述的ZnSO4水溶液中68Zn的摩尔比为5?15 %。作为改进，所述的同位素68Zn标记液还包括0.05?0.15%1%的表面活性剂5丨1?的L-77。表面活性剂用于降低同位素68Zn标记液的表面张力，提高同位素68Zn标记液在叶片表面的吸附量，增强叶面喷施效果。
[0022]作为优选，所述的三酸消煮是指:将烘干磨碎后的样品分散于三酸消煮液中，先进行常温消煮，消煮温度为20?28°C，时间为1.5?2.5h，再进行高温消煮，消煮温度为120?1400C，时间为4?6h;所述的三酸消煮液组成为:体积比为4.5?5.5:0.5?1.5:1的浓硝酸、高氯酸和氢氟酸的混合液。
[0023]作为优选，所述的冷冻切片的温度为-16?-20 °C，切片厚度为60?ΙΟΟμπι。温度依据样品的性质可作适当调整，过低容易使样品组织破碎，过高则组织冷冻硬度不够，易导致切片不成型或出现褶皱。
[0024]作为优选，所述的冷冻切片是指:将叶柄用OCT包埋剂包埋固定，置于冷冻切片机中进行切片。
[0025]作为优选，所述的步骤4)中的μ-XRF原位分析、LA-1CPMS验证分析和ICP-MS定量分析是指:将冷冻干燥后的样品通过同步辐射荧光探针μ-XRF技术对样品中锌元素进行定位，同时利用激光刻蚀-电感耦合等离子体质谱LA-1CPMS技术进一步定量分析样品中68Zn的原位分布特征；利用电感耦合等离子体质谱ICP-MS技术测定三酸消煮后液体样品中的锌含量。
[0026]上述同步辐射微荧光探针μ-XRF技术可原位无损分析生命体内各金属元素的分布特征和形态信息。新一代XRF技术检测限可达ppm量级，空间分辨率为微米乃至纳米级(Nano-XRF，Nano-XRF-CT)，可表征生命体中元素在亚细胞水平上的定位信息。
[0027]上述μ-XRF实验条件优选为:利用带有谐波抑制的Si(220)双晶单色仪使得入射光为单色光，利用Kirkpatrick-Baez显微镜聚集光斑，光斑大小为2μηι，样品打点角度为45°，利用单通道涡流Si检测仪检测荧光信号；光斑步长及扫描时间依据样品性质可作适当调整。
[0028]上述激光烧蚀电感耦合等离子体质谱LA-1CPMS技术是近几年发展起来的生物组织样品中元素成像技术，其可分析元素的同位素丰度，检测限为亚ppm级，分辨率为ΙΟμπι。相较于XRF，LA-1CPMS优势在于灵敏度高，在分析低丰度样品时有一定优势，但分辨率不如前者。
[0029]上述LA-1CPMS实验条件优选为:LA系统采用Nd: YAG激光器(波长213nm，重复频率1Hz，激光参数设置为40%)，扫描光斑直径为5μπι;植物样品切片固定于样品台上，置于样品室内聚焦激光束按行扫描样品，行与行之间的间隔设置为ΙΟμπι，灼烧后的样品物质由载气氦气和氢气混合气体送入ICP检测离子强度。为了校正水分流失及样品厚度对ICP的影响，需要同时检测13C的离子强度，将13C作为内标元素；用Ba和Rh标准样品最优化ICP-MS参数，并选取美国标准与技术研究院(NIST)的标准参比物作为参比物质。
[0030]若无特殊说明，本发明中各溶液均采用超纯水配制。
[0031]同现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
[0032]基于同位素示踪与金属组分析技术(y-XRF、LA-1CPMS、ICP_MS)，创建并优化了叶面锌肥肥效的原位评价方法，突破了传统叶面肥肥效评价技术存在的耗时长、见效慢等技术瓶颈，率先在细胞水平上原位表征了植物体内锌的分布特征及其动态变化规律。
【附图说明】
[0033]图1为实施例1中同位素68Zn标记液标记示意图；
[0034]图2为实施例1中空白对照组的Zn元素的微区分布特征示意图；
[0035]图3为图1中区域B的Zn元素的微区分布特征示意图；
[0036]图4为图3中区域B进一步细扫的微区分布特征示意图；
[0037]图5为图4进一步细扫的微区分布特征不意图；
[0038]图6为实施例1中LA-1CPMS定量分析待测叶片的锌元素分布图；
[0039]图7为实施例2中同位素68Zn标记液标记示意图；
[0040]图8为实施例2中叶柄切片样品的显微组织图；
[0041]图9为实施例2中叶柄切片样品的Zn元素的微区分布特征示意图，ck为对照组，Zntreatments为实验组；
[0042]图10为实施例2中LA-1CPMS定量分析叶柄切片样品的锌元素分布图；
[0043]图11为实施例2中ICP-MS定量分析图，ck为对照组，Zn为实验组，Pet1le为叶柄切片样品，New leaf为新生的新叶。
【具体实施方式】
[0044]实施例1
[0045]1、溶液配制
[0046]同位素68Zn标记液:4mL68Zn溶液(Isotec公司，Miamisburg，Oh1)，0.8g硫酸锌，ImL Silwet L-77，溶于超纯水中并定容至1L。
[0047]2、标记同位素68Zn标记液
[0048]用两层塑料薄膜覆盖住土壤表面，防止喷施同位素68Zn标记液时肥料滴入土壤中，再于塑料薄膜上覆盖两层吸水纸，用胶纸将塑料薄膜和吸水纸封严实，仅留出可供安装滴灌的开口。
[0049]选取实验植株为Prunus dulcis(Mill.)DAWebb品种杏树，将完全展开的成熟叶片作为待标记叶片，用去离子水清洗叶片上表皮和下表皮，再用吸水纸轻轻吸干备用。
[0050 ] 将羊毛脂(Lano lin,Si gma公司)均勾地涂抹在所选待标记叶片的叶柄表面，并用Teflon膜小心将叶柄包裹完全。
[0051 ]将配置好的稳定性同位素68Zn标记液转移至5mL离心管中，用方形玻璃纤维滤纸蘸取同位素68Zn标记液后，贴于所选待标记叶片的特定部位A，如图1所示，用保鲜膜将滤纸固定于该位置上进行稳定性同位素68Zn标记液标记处理。
[0052]3、样品制备
[0053]上述实验植株处理7天后，轻轻取下玻璃纤维滤纸，于