磷酸胆碱偶联物和相应抗体的制作方法
【专利说明】
[00011本申请是基于申请日为2005年4月15日，优先权日为2004年4月15日，申请号为 200580019701.9，发明名称为："磷酸胆碱偶联物和相应抗体"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及动脉粥样硬化和缺血性心血管疾病的治疗和风险评估领域。
【背景技术】
[0003] 动脉粥样硬化是一种慢性疾病，引起大动脉和中等大小动脉的最内层（内膜）增 厚。它使血流缓慢，并可以在由受感染血管供血的器官中引起缺血和组织破坏。动脉粥样硬 化是导致心肌梗塞等心血管疾病、中风和外周动脉疾病的主要原因。它是西方国家的主要 死因，预计不出二十年，将成为全球最主要的死亡原因。
[0004] 这种疾病始于血管的细胞外基质中积累脂蛋白，主要是低密度脂蛋白（LDL)。这些 LDL颗粒聚集并发生氧化。氧化后的LDL具有促炎特性和毒性，引起血管损伤。动脉粥样硬化 在很多方面代表了对这种损伤的一种反应，包括炎症和纤维变性。
[0005] 1989年，Pal inski及其同事鉴定出人体内抗氧化型LDL的循环自身抗体。这一发现 提示，动脉粥样硬化可能是由抗氧化型脂蛋白的免疫反应引起的自身免疫病。同一时期，多 个实验室开始寻找抗氧化型LDL抗体滴度与心血管疾病之间的关系。但这些研究没有得出 明确的结论。目前已经有针对氧化型LDL表面众多不同表位的多种抗体，但这些表位的结构 尚不清楚。因此，术语"氧化型LDL抗体"是指多种不同抗体的未知混合物，而不是指一种特 殊的抗体。
[0006] 众所周知，动脉硬化病灶存在持续炎症，其特征是免疫活性细胞被活化，产生炎性 细胞因子。已经确认的风险因素，例如高血压、血脂、糖尿病和吸烟都很可能促进这种炎症 反应，但这种现象的发生机制尚不明确，存在多种互不相干的排他性可能性。已经有人提出 多种可以引起该免疫反应的自身抗原，包括氧化型低密度脂蛋白（oxLDL)和热休克蛋白 (HSP) 2,3。有关免疫反应在动脉粥样硬化中的作用的现有信息提示一种复杂的关系。其中一 种情况是，在动物模型中进行免疫接种，以便影响动脉粥样化的形成。当使用HSP时，动脉粥 样硬化增加，当以oxLDL作为抗原时，动脉粥样硬化减少 4,5。
[0007] aOxLDL在人类疾病中的作用似乎比较复杂。此前有人证实，aOxLDL在健康对照人 群中的水平高于临界高血压(borderline hypertension，一种早期心血管疾病6)人群。近 期研究与该发现是一致的7, 8。另一方面，有多位研究者报道，aOxLDL在人类心血管疾病 (CVD)中升高，尤其是在晚期疾病中2, 3,9，1()。实例之一是系统性红斑狼疮(SLE)以及与CVD极 高风险有关的自身免疫病。有CVD病史的SLE-患者aOxLDL水平明显升高 n。这些在某种程度 上相互矛盾的结果可能主要是由于:LDL-氧化的不同方法和状态在抗原性方面产生差异。 疾病阶段和风险系数变化谱都倾向于与抗体水平相关。
[0008] 氧化型低密度脂蛋白（oxLDL)本身具有多种促炎特性，包括活化T细胞12'13，单核细 胞/巨噬细胞和内皮细胞^'OxLDL还在来自动脉粥样硬化病灶的免疫活性细胞中促进炎 症17。但要注意，oxLDL也可以缓解急性炎症反应，并替代促进更低级的慢性炎症，这在动脉 粥样硬化中可见18。有趣的是，oxLDL的多种生物学活性是由oxLDL中的血小板活化因子 (PAF)-样脂质引起的 19_21。
[0009] 磷酸胆碱(口11〇8口11〇巧1〇11〇1;[116，？(])不仅是血小板活化因子?4?(它在与?4?-受体 相互作用时是必需的）等炎症性磷脂和oxLDL中的主要成分，还可以作为肺炎链球菌 (S.Pneumoniae)等多种细菌的免疫原成分 22。而且，PC由凋亡细胞表达2'23〇
[0010] 在US5455032中，在用于提供抗感染（例如肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae))的免疫保护的疫苗中使用磷酸胆碱偶联物。Binder等人最近对小鼠中肺炎球 菌疫苗的研究 24显示，免疫接种减少了动脉粥样硬化灶的形成。有研究发现，由动脉粥样硬 化小鼠产生的多种抗oxLDL自身抗体与提供抗常见感染性病原体(包括肺炎链球菌)的保护 作用的抗体有相同的结构。在小鼠、而非人类中的研究并未提供任何关于特异性的信息，也 未能提示，IgM抗-磷酸胆碱抗体在动脉粥样硬化中是比相应IgG抗体明显更为重要的保护 因子。此外，磷酸胆碱偶联物未被用于肺炎球菌疫苗中。
[0011 ] 另一项研究25显示，抗磷酸胆碱抗体水平在牙周病(periodontal diseases)患者 体内升高。其结论是，磷酸胆碱是与牙周菌群中生物相关的重要的口腔抗原，而抗-PC抗体 水平的升高是牙周患病的结果。至今尚无动脉粥样硬化的抗体和可能的保护作用或进展的 任何信息。
[0012]目前已有多篇关于动脉粥样硬化的免疫接种治疗的文献被公开(如W02002080954 和TO0168119)，但这些是基于使用脱脂载脂蛋白B的肽片段或抗T细胞受体alpha/beta链的 抗体。有一篇文献(W09908109)描述了用抗脂蛋白表面氧化作用特异性表位的单克隆抗体 检测动脉粥样硬化斑的方法。与该方法不同的是，本发明的方法使用磷酸胆碱偶联物检测 受试者样品中的I gM或I gG等抗体。
[0013] 发明简述
[0014] 本发明涉及药物组合物及其在治疗、预防动脉粥样硬化，例如治疗、预防或缓解动 脉粥样硬化的进一步进展方面的用途，所述药物组合物包含磷酸胆碱偶联物、或特异性针 对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体。本发明还涉及磷酸胆碱偶联物或所述抗 体制剂，例如单克隆抗体在制备药物组合物中的用途，所述偶联物或抗体制剂可以与佐剂 组合或者不与佐剂组合。本发明还涉及诊断有无抗体，例如IgM或IgG抗体的方法，所述抗体 与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0015] 本发明第一方面提供了药物组合物在制备免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬 化或动脉粥样硬化相关疾病的药物中的用途，所述药物组合物包含至少一种磷酸胆碱偶联 物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述哺乳动物包括人。所 述药物是用于对动脉粥样硬化有致免疫特性或治疗特性的免疫接种。
[0016] 本发明第二方面提供了免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬化或动脉粥样硬化 相关疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含至 少一种磷酸胆碱偶联物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述 哺乳动物包括人。所述药物组合物是用于对动脉粥样硬化有致免疫特性或治疗特性的免疫 接种。
[0017] 磷酸胆碱偶联物是指磷酸胆碱组分与载体相连，优选通过间隔臂（spacer)相连。 作为结构性组件的磷酸胆碱可包括磷酸胆碱衍生物。合适的磷酸胆碱偶联物实例可参见us 5，455，032，见上文。例如，US 5，455，032提供了这样的磷酸胆碱偶联物，其中磷酸胆碱组分 借助直链烷基和酰胺键与各种不同的免疫学载体相连。所述磷酸胆碱偶联物可以是，例如 人血清白蛋白（HSA)-或匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)_磷酸胆碱偶联 物或牛血清白蛋白（BSA)-磷酸胆碱偶联物(例如见实施例）1C-BSA(磷酸胆碱-牛血清白蛋 白）可以从Biosearch Technologies，INC(Ca，USA)购买。HSA-BSA可以通过化学方法偶联， 所述方法举例如下：
[0018] 可以按照Chesebro，Β·在Biochemistry 11，（ 1972) 766中所述方法，以含 10%钯的 活性碳(charcoal)作为催化剂，使0-(4-硝基苯基-磷酰基)-胆碱(Sigma N 5879)与氢气在 latm进行还原反应，大量产生0-(4-氨基苯基磷酰基)-胆碱(I)。
[0019] 用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亚胺）的MES液(pH 4)使（I)与HAS偶 联，方法基本如?8(1;[11&，10.等在]\ Immun · .Methods 293(2004) 1-11 中所述。偶联的HAS可 以通过对经过缓冲的盐水(pH 7.4)透析而被分离。
[0020] 载体可以是，例如，蛋白质、脂质或聚合物。载体可以是乳胶珠，例如实施例中所 述。
[0021 ]所述药物可以用于注射给药。
[0022]本发明另一方面提供了在先任一方面定义的一或多种磷酸胆碱偶联物在制备免 疫治疗或治疗缺血性心血管疾病的药物组合物中的用途，可以与佐剂组合或不与佐剂组 合。
[0023] 本发明又一方面提供了预防性治疗或治愈性治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物 是指患有动脉粥样硬化或者有患缺血性心血管病的风险的哺乳动物，例如人，所述方法包 括施用治疗有效量的至少一种磷酸胆碱偶联物、或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制 剂，例如单克隆抗体。
[0024] 本发明还涉及确定有无抗磷酸胆碱的抗体，例如抗磷酸胆碱的IgM或IgG抗体的方 法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0025] 本发明又一方面提供了用磷酸胆碱偶联物诊断有无抗体，例如IgM或IgG抗体的方 法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0026] 故而本发明还有一方面提供了磷酸胆碱偶联物在评估患者发生或进展缺血性心 血管疾病的风险的方法中的用途，在所述方法中，评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应 的抗体，例如I gM或I gG抗体的水平。
[0027] 磷酸胆碱偶联物已经在上文中描述。磷酸胆碱可以与载体通过间隔臂相连。所述 载体可以是蛋白质，这可以是KLH(匙孔血蓝蛋白）或人血清白蛋白（HSA)。所述载体可以是 乳胶珠。
[0028]所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体的水平可以用免疫 分析方法评估。合适的免疫分析方法的实例在下文中描述，并且是本领域技术人员在任何 情况下都明显可以得知的。
[0029]可能需要测定与oxLDL或MD-LDL反应的抗体以及测定与磷酸胆碱偶联物反应的抗 体，例如IgM或IgG抗体。或者，或进一步地，可能需要测定HSP70，HDL，TNF和/或HSP60的水平 (见实施例）以及测定与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体的水平。
[0030] 发明详述
[0031] 以下实施例旨在举例说明本发明，不应认为是对权利要求所概括的保护范围作任 何限制。本文提到的文献都引入作为参考。
[0032] 这里描述了一例测定与缺血性心血管疾病患病风险升高或降低相关的抗磷酸胆 碱I gM抗体存在与否（或水平）的方法。也可以用本领域已知的其它方法。类似的方法可以用 于测定抗磷酸胆碱IgG抗体的存在与否(或水平）。
[0033] 测定抗磷酸胆碱的IgM抗体存在与否的方法
[0034]用酶联免疫吸附法测定抗PC-BSA的IgM抗体。
[0035]微量滴定板用PC_BSA( 10μg/ml;例如可以购自Biosearch Technologies，INC(Ca, USA)的磷酸盐缓冲液（PBS)包被。用PBS洗板，然后将板用2 %BSA溶液封闭。血清样品用 0.2 %BSA-PBS稀释（1:30)。将微量滴定板40°C保温过夜，洗板。添加碱性磷酸酶偶联的山羊 抗-人IgM(用样品缓冲液稀释成1:7000)，1001!1/孔，40°(：保温过夜。洗板后，添加碱性磷酸 酶底物，将板于室温避光保温60min，进行显色。在分光光度计中读取405nm处的吸光度。 [0036] 测试了磷酸胆碱的不同载体(carrier)和间隔臂（spacer)。载体不限于举例的这 些。也可以用本领域已知的其它载体，如蛋白质、脂质或聚合物，例如乳胶珠。载体可以参见 上文中提到的US 5,455,032。
[0037]由本发明方法检测到的IgM或IgG抗体还可以结合含有暴露在表面的磷酸胆碱 (PC)的化合物中的PC，例如溶血磷脂酰胆碱（lysoPC;see,for example,Kim et al，J Exp Med. 2002Sep 2; 196(5) :655-65)中的PC。因此，本发明的方法可以检测与溶血磷脂酰胆碱 结合的I gM或I gG抗体。
[0038] 合成磷酸胆碱偶联物和制备药物组合物
[0039] 将乳胶珠（0 · 20μηι或0 · 81μηι)悬浮在PBS中，与10μg/ml磷酸胆碱-BSA溶液混合过 夜。然后将这些珠离心，用缓冲液洗数次，用lOμg/ml BSA溶液封闭。再洗一次，然后将这些 珠重悬于适当的缓冲液中达到适当的浓度，冰箱保存备用。
[0040]