一种基于蛋白纳米线的3d探针-磁性微珠复合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物及其在免疫检测中的应用。
【背景技术】
[0002]各种传染性疾病大范围的流行传播，对我国的国家安全和人口健康造成严重威胁。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场快速检测;基于病原核酸的检测方法大多具有较高的检测灵敏度，但需要复杂的核酸抽提过程，而且容易出现假阳性;免疫学方法因基于抗体对病原的特异性识别作用而具有较好的特异性，同时操作简单，因此，广泛应用于临床和基础研究的各个领域。
[0003]常规的免疫分析方法，如ELISA，其过程主要依赖于抗体的特异性捕获和固相亲和分离等过程，因此有着特异性好，背景信号低，灵敏度高等特点。但随着社会的不断发展，在海关、口岸和CDC等进出口人员、货物密集交通的地方，对现场、快速、高灵敏的病原检测有着非常高的要求，也是国家疾病防控的重要关口。目前，常规的ELISA检测中，固定蛋白探针是通过物理吸附作用，使得蛋白探针随机取向，且吸附作用是在二维平面上的，其固定密度较低，导致捕获检测物的效率降低而限制其灵敏度;在操作过程中，包被、封阻、结合、洗涤需要花费大量时间，限制了对样品的现场检测。而快速免疫分析方法，如试纸条等，虽然能够实现快速检测，但由于该方法通常通过肉眼识别纳米金聚集显色，其灵敏度更是低于ELISA。针对于此，我们亟需开发一种快速、高灵敏的免疫检测方法。
[0004]现有提高蛋白探针固定有效方向和密度而调高灵敏度的方法有:亲和作用(Analytical Chemistry,1999,71(17): 3846-3852.)、娃纳米线介导(Natureb1technology ,2005,23(10): 1294-1301.)、病毒纳米颗粒介导(Nature nanotechnology,2009，4(4): 259-264.)、巨磁阻介导(Nature nanotechnology，2011,6(5): 314-320.)等。
[0005]亲和作用介导的固定法是通过亲和素-生物素系统，使得探针的固定随机性降低，从而提高有效探针密度;硅纳米线介导的固定法是在硅纳米线表面修饰上醛基，将抗体探针通过氨基与醛基形成化学键而在其表面展示，达到高密度的固定;病毒纳米颗粒介导的固定法是将SPA融合在病毒衣壳蛋白亚基上，通过SPA与抗体的作用而展示抗体，另外通过病毒衣壳蛋白上的His-tag与镍纳米阵列作用，达到高密度的固定;巨磁阻介导的固定法是利用亲和素-生物素系统将抗体结合在磁颗粒上，磁颗粒通过巨磁阻效应固定在界面上，从而达到抗体探针的高密度展示。
[0006]上述方法中，提高蛋白探针的固定密度主要通过两种途径来实现:一、通过特异性的固定代替随机的物理吸附；二、提高固定蛋白探针的数量。前者提高探针数量有限，如亲和作用介导的固定只能在一定程度上解决探针随机取向的问题，并不能提高真实探针密度；而病毒纳米颗粒介导的固定法受限于病毒颗粒的大小，固定的探针数量有限，且His-tag与镍的作用不稳定。后者需要通过复杂的化学修饰过程，或者需要复杂的仪器和操作步骤，成本高昂，如纳米材料虽然能够提高比表面积，但其修饰方法随机、复杂，且在修饰过程中会损伤蛋白探针的生物活性，导致捕获能力降低。
【发明内容】
[0007]本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的在三维(3D)空间上的免疫检测。
[0008]为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0009]本发明一方面提供一种基于蛋白纳米线的3D探针-磁性微珠复合物，包括磁性微珠和蛋白纳米线，所述蛋白纳米线通过成线蛋白自组装形成，且所述蛋白纳米线表面包括至少一种功能配体和至少一种连接配体，所述蛋白纳米线通过连接配体连接在磁性微珠表面。
[0010]本发明中，所述磁性微珠是指具有一定磁性及特殊表面结构的纳米或微米尺度的微球，其可由无机磁性物质及各种含活性功能基团的材料组合而成。其中，所述无机磁性材料包括磁性纳米/微米材料或磁性纳米/微米复合材料，优选的，所述磁性纳米/微米材料包括磁性元素(如铁、钴、镍、钕、硼、错、络等)掺杂的纳米/微米材料，例如，氧化铁(Y-Fe2O3,γ -Fe304)、铁氧体(CoFe204，BaFei20i9)、氧化络(Cr02)、氧化错(Zr02)、氮化铁(Fe4N)、金属合金(Fe、Co、N1、Al)等。所述含活性功能基团的材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙醇酸、聚丙烯酸、硅烷衍生物等合成高分子材料或纤维素及其衍生物、琼脂糖、明胶、葡聚糖、壳聚糖及其衍生物、透明质酸、海藻酸等天然高分子材料。
[0011 ]本发明中，磁性微珠一方面可在外加磁场的作用下快速定位、导向和分离，另一方面可通过表面改性或化学聚合等赋予磁性微珠表面多种活性功能基团，如羟基、羧基、醛基、氨基等，此外，磁性微珠也可以通过共价键来结合抗体、细胞、DNA等生物活性物质。
[0012]在本发明一【具体实施方式】中，所述成线蛋白为含有能够组装成线性纳米结构自组装结构域的蛋白，例如可为酵母朊蛋白Sup35、淀粉样蛋白Ure2、丝素蛋白等。优选的，成线蛋白为酵母朊蛋白，311?35的第1-61位氨基酸为自组装结构域。
[0013]在本发明一【具体实施方式】中，所述功能配体和连接配体可相同或不同，并独立的选自以下组中的一种或多种:抗原、具有特异性结合能力的功能化抗体、蛋白A(Protein A，SPA)、蛋白G(Protein G，SPG)、SPL蛋白、本周蛋白(BJP)、β2_巨球蛋白(f32m)、降钙素(CT)、人绒毛膜性腺激素(hCG)、促肾上腺皮质激素(ACTG)、甲状腺激素(PHT)、荧光蛋白、生物素和未和素等。
[0014]本发明中，所述抗原包括与自身免疫缺陷、恶性细胞或癌症相关的抗原、病毒抗原或微生物抗原，包括但不限于，能够引起免疫应答的任何病毒肽、微生物肽、多肽蛋白、糖类、多糖脂质分子，如 HIV-p24、HIV-gp41、HIV-gpl20、HIV-gpl60、HIV-nef、HAl、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HBsAg、HBcAg、EboIa、EV71、SV40、HTLV-1、CBV、EB、SARS、CEA、AFP、PSA、POA、PSCA、PSMA、CA125、CA19-9、CAl5-3、CA50、CA242、TNF-α、RSV-F、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD56、CD70、CD79、CD79b、CD90、CD125、CD134、CD147、CD152/CTLA-4等。
[0015]本发明中，可通过连接配体将蛋白纳米线与磁性微珠相连，蛋白纳米线结合磁性微珠大的比表面积形成3D结构，提高固定密度;通过融合在蛋白纳米线上的功能配体实现与目标分子的特异性结合，提高抗原或抗体等固定取向性，从而进行抗体筛选或病原或疾病检测。
[0016]优选的，所述连接配体为生物素。
[0017]优选的，所述功能配体选自抗原、SPA、SPG或SPL等，优选自以下组中的一种或多种:HIV-p24、HIV-gp41、HIV-gpl20、HIV-gpl60、HIV-nef、HAl、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HBsAg、HBcAg、EboIa、EV71、SV40、HTLV-1、CBV、EB、SARS、CEA、AFP、PSA、POA、PSCA、PSMA、CAl25、CAl9-9、CAl5-3、CA50、CA242、SPA、SPG等。
[0018]在本发明一【具体实施方式】中，所述蛋白纳米线通过生物素-亲和素相互作用、化学共价交联(例如表面羧基功能化的磁性微珠与蛋白纳米线上的氨基共价交联，过渡金属离子如Co、N1、Cu、Zn等离子与特定氨基酸侧链之间的相互作用，如天然组氨酸标签HAT、聚组氨酸标签His tag与NTA-Ni(亚硝基三乙酸-镍)或Co-CMA(钴-羧甲基天冬氨酸)之间的相互作用、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)的结构域与蛋白之间的相互作用、纤维素结构域与纤维素之间的相互作用或者其它相互作用多肽)、特异性DNA-蛋白相互作用(例如表面特异性DNA功能化的磁性微珠与特异性蛋白融合的蛋白纳米线相互作用)或其它高亲和力和强特异性结合的方式连接在磁性微珠表