一种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于医学免疫学领域，涉及一种荧光免疫层析技术，进一步地，本发明涉及一种用稀土荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其试剂盒，以实现快速准确的对磷酯酰肌醇蛋白聚糖3进行定量分析。
【背景技术】
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[0002]原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是目前世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一，确诊后的五年生存率不足12 %，近年来其发病率在世界范围内有增高趋势。外科切除仍是目前PHC最常用的治疗方法，但大多数患者就诊时已属中晚期，失去了最佳手术治疗时机，因而提高PHC的早期诊断水平是提高肝癌治疗和预后效果的关键。甲胎蛋白(AFP)是目前全世界应用最广泛的肝癌肿瘤标记物，但PHC患者AFP敏感性仅为35%-65%，特异性不到80%，尤其是早期肝癌阳性率更低，以此作为PHC早期确诊的方法并不十分理想，迫切需要寻找新的标记物。磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是近来发现的具有潜在价值的肝癌血清标记物。
[0003]GPC3属于膜性硫酸乙酰肝素类糖蛋白超家族成员，具有羟基末端连接在细胞膜上，氨基端游离在细胞外的特殊结构，被认为与定位，输送有关。它是由蛋白质、脂类和糖三者共价连接的复杂糖复合物，其氨基端(N)为可溶性蛋白，在肝癌细胞中表达时可分泌至外周血液中，这是外周循环血液中能够检测到GPC3的分子生物学基础。临床基础研究显示，肝细胞发生癌变时GPC3可异常表达，激活的GPC3可通过多种信号传导通路促进肝细胞恶性转化，增强其侵袭转移能力。单一 GPC3或AFP在PHC表达有限，而联合GPC3和AFP检测显著提高PHC诊断的敏感性和特异性，分别达84.2 %和95.7%,显著高于AFP或GPC3单独检测。能改善PHC诊断水平。尤其是利用GPC3检测可以提高AFP阴性PHC的诊断水平，对PHC早期诊断和筛查具有一定意义，是提高PHC早期诊断和鉴别诊断水平的有意义的指标。
[0004]磷酯酰肌醇蛋白聚糖3检测方法主要有双抗夹心法(ELISA)和免疫组化法，ELISA法操作时间长、自动化程度低，定量检测不够准确;免疫组化法需要组织切片，而且在PHC早期不能进行组织取样，无法在早期获得结果进行早期诊断。因此开发灵敏度更高、快捷方便的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3产品，仍是临床诊断产品研究领域亟需解决的重要问题。
【发明内容】
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[0005]本发明所要解决的技术问题是针对上述【背景技术】的不足，利用荧光免疫层析的灵敏性，结合荧光免疫层析分析仪，来提供一种灵敏度高、快捷简便，可以准确定量的用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其试剂盒。
[0006]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:一种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法，该方法能够对磷酯酰肌醇蛋白聚糖3进行定量测定，具有灵敏度高、操作简便快速、适合现场检测等优点；本发明的另外一个目的是提供一种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒，可以应用于各级医院急诊科以及基层医院。
[0007]本发明所述的用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的试剂盒，其特征在于试剂盒由试纸卡和荧光免疫层析分析仪构成。
[0008]所述试纸卡，是在PVC板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸，然后切割成4mm宽的试纸条，将试纸条装入塑料卡内形成试纸卡。
[0009]优选地，所述结合垫上吸附有稀土荧光微球，稀土荧光微球的直径为80-220nm，进一步优选地，所选用的稀土荧光微球的直径是120-150nm。
[0010]优选地，所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素，包括铕(Eu)、钐(Sm)、铒(Er)、钕(Nd)中的任意一种或几种。
[00?1 ]优选地，所述稀土焚光微球含有稀土络合物，在基态下稳定，在320-360nm的激发光源作用下，能够发射出波长范围在540-580nm的荧光。
[0012]所述结合垫上稀土荧光微球标记的抗体为稀土荧光微球标记的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3抗原表位的单克隆抗体细胞株。
[0013]进一步优选地，结合垫上稀土焚光微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。
[0014]所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，用于对检测结果的定量判定，对磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的检测范围为0-800ng/mL。
[0015]本发明所述的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3荧光免疫层析检测试纸盒的制备方法，包括以下步骤:
[0016]A、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备过程如下:
[0017]步骤1)、单克隆抗体细胞株的获得:参照磷酯酰肌醇蛋白聚糖3氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成18个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株。
[0018]步骤2)、单克隆抗体的制备:采用标准的腹水生产工艺制备并纯化磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，分装后保存于-20 °C备用。
[0019]B、稀土荧光微球的醛基化:
[0020]取3mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为10分钟，最后重悬于ΙΟΟμΙ的上述碳酸盐缓冲液中。加入200μ1醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时。采用同样的离心法洗涤和重悬到ΙΟΟμΙ的上述碳酸盐缓冲液中，置于4 C备用。
[0021]C、稀土荧光微球标记的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体的制备:
[0022]将Img磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4°C透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4°C反应过夜。然后，加入硼氢化钠至终浓度10mM，4°C反应4小时;再加入等体积的封闭液(150mM Tris-HCL，pH7.5，含2.5 %BSA，3 %蔗糖)，4°C封闭过夜；然后用150mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于ΙΟΟμΙ的150mM Tris-HCL缓冲液中(含2%NaCL，l%BSA，0.3%Tween 20)，4°C避光保存备用。
[0023]D、吸附荧光微球标记的抗体的结合垫的制备:
[0024]将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中(含I.5%Triton X-100,2%BSA,P H 7.5 )，4 °C浸泡4小时，然后取出3 7 °C烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在B i ο -DotXYZ3050三维喷点平台上，用B1-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37°C烘干4小时，备用。
[0025]E、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备:
[0026]步骤I)、采用与获得结合垫上磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，保存于-20°C备用。
[0027]步骤2)、分别用包被稀释液将磷酯酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到8mg/ml，膜液量为1.5yl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为4.5_，然后置于烘箱中，37°C烘干4小时。
[0028]F、样品垫的制备:
[0029]将玻璃纤维膜浸泡于0.2MTris缓冲液(pH7.5)，1.5%Triton X-100，2%BSA的处理液中，于4°C浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37°C烘干4小时。
[0030]G、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3荧光免疫层析检测试纸卡的组装
[0031]在PVC板上依次粘贴经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。
[0032]—种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法，包括以下步骤:I)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放;2)精确吸取ΙΟΟμΙ血清样本，样本为全血时吸取150μ1样本，加入到样本孔中，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果;3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果O
[0033]本发明提供一种利用稀土荧光免疫层析技术制备的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3快速定量免疫层析检测试剂盒，同时适合血清和全血样本，并适合临床上单人份检测，能定量检测样本中的磷酯酰肌醇蛋白聚糖3含量，具有明确的临床指导意义。试剂盒具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、适合现场检测和经济实用等优点。
【附图说明】
[0034]图1是本发明的试验结果的准确度分析图。
【具体实施方式】
[0035]实施例1:磷酯酰肌醇蛋白聚糖3荧光免疫层析检测试剂盒的制备
[0036]!主要材料:
[0037]1.1、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3特异性配对抗体:艾博抗上海贸易有限公司；磷酯酰肌醇蛋白聚糖3质控品:北京义翘神州生物技术有限公司；稀土荧光微球:上海甄准生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC)膜:Mil Iipore