标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312/0 mU/ml的浓度 梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液;加入待测 样本于检测板内，再加入检测缓冲液2稀释。
[0032] 唾液酸酶标准溶液梯度根据精子唾液酸酶的表达量和本方法所能检测到的灵敏 度而设定的。
[0033] 优选地，所述的检测板为96孔黑板，本发明采用荧光法来测定唾液酸酶的活性，黑 色的检测板对灵敏度和特异性是最佳的，可以保护荧光染料不被光线淬灭，明显降低光线 对荧光试剂淬灭的负面影响，从而使检测的灵敏度、稳定性和准确性得到大大提高。
[0034] (2)用检测缓冲液2稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本 的孔内，再将检测板置于37°C避光孵育1-2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液 酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的 值即可。
[0035] 优选地，用检测缓冲液2稀释至荧光试剂的浓度为0.05mM，为最佳的工作浓度。 [0036]优选地，酶标仪在激发波长和发射波长分别为365nm和450nm的波长下读取各孔荧 光强度。365nm为最佳激发波长，450nm为最佳发射波长。
[0037]唾液酸酶活性/蛋白浓度的单位酶活值(U AUS/g protein)反映单位精子蛋白的 唾液酸酶活性定量值，根据单位酶活值的数据可作出人群表达唾液酸酶活性的临界值。 [0038]根据该临界值，可在临床上通过单位酶活值初步判断精子的功能质量，据目前已 有的数据，对于正常生育男性和不育患者，此临界值约为0.2;对于运动能力良好的精子和 运动能力较差的精子，此临界值约为0.24;对于活率正常的精子和活率低下的精子，此临界 值约为0.3。
[0039] 优选地，用于检测的孔内样本唾液酸酶活性应在0.3_5mU/ml范围内，如果超出则 应将孔内待测样本的唾液酸酶活性值调整在此线性范围之内。
[0040] 本发明的有益效果在于： 1、本发明试剂盒中的试剂均选择常规试验试剂，并结合对精子检测的特殊性，降低了 实验成本，所需的仪器设备、耗材种类少，仅为离心机、酶标仪、EP管、枪头和检测板等，均为 常规实验室配置;并且操作方法简单，仅为离心、加样等，不存在需多次练习才能获得操作 技巧的情况，可广泛应用于临床实验室和常规技术人员使用。
[0041] 2、本发明的试剂盒用于评估精子本身质量，筛查不孕不育的原因。根据单位酶活 值的数据可作出人群表达唾液酸酶活性的临界值，根据该临界值，可在临床上通过单位酶 活值初步判断精子的功能质量，用于评价男性不育的可能潜在原因，尤其是针对临床上不 明原因性不育是否与唾液酸酶活性有关的情况。
[0042] 3、本发明对精子进行充分的洗涤，充分除去残留的精浆成分，使精浆中残留的蛋 白及唾液酸酶不会影响检测结果的准确性;优化了测精子蛋白浓度时设置的标准品蛋白浓 度梯度和测酶活时设置的标准品酶活梯度，如果梯度设置不合理，均会很影响结果的灵敏 度和准确性;使用黑色检测板测酶活，可明显降低光线对荧光试剂淬灭的负面影响，由此大 大提高实验结果的稳定性、灵敏度和准确性;最终的检测结果设计为唾液酸酶活/蛋白浓度 的值，这样可降低不同样本之间的差异，使彼此更具有可比性，保证检测结果的稳定性和可 靠性。
【附图说明】
[0043]图1为采用本发明试剂盒分别测定正常精子（人)和不育精子（人）的唾液酸酶活 性/蛋白浓度的单位酶活值。
【具体实施方式】
[0044] 下面结合【具体实施方式】对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。
[0045] 实施例1 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.2; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0046] 采用本发明的试剂盒分别测定正常精子(人)和不育精子(人)的唾液酸酶活性，结果显 示正常精子的唾液酸酶活性明显高于不育精子(见图1)。
[0047] 实施例2 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.3; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0048] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
[0049] 实施例3 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为BWW培养液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.25; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0050] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
[0051 ] 所述的荧光试剂是Y -4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸钠。
[0052] 实施例4 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为BWW培养液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.28; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0053] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
[0054] 所述的荧光试剂是Y -4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸钠。
[0055]所述荧光试剂的浓度为10mM。
[0056] 实施例5 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.2; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0057] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
[0058] 所述的荧光试剂是Y -4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸钠。
[0059]所述荧光试剂的浓度为10mM。
[0060] 所述乙酸钠的pH值为5。
[0061 ] 实施例6 一种精子质量评估的试剂盒，所述的试剂盒包括不含酶活抑制剂的细胞裂解液、检测 缓冲液1、蛋白酶抑制剂cocktai 1、试剂A液、试剂B液、牛血清白蛋白、荧光试剂、唾液酸酶标 准原液和检测缓冲液2; 所述的检测缓冲液1为磷酸缓冲液； 所述的试剂A液为：1 %BCA二钠盐，2%无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠， 0.95 %碳酸氢钠，混合调pH值至11.3; 所述的试剂B液为:4 %硫酸铜； 所述的检测缓冲液2为含0.05 mmol/1乙酸钠和0.25yg/yl牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液。
[0062] 所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml。
[0063] 所述的荧光试剂是Y -4-甲基伞形酮基-a-D-N-乙酰神经氨酸