基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器。
【背景技术】
[0002]氨苄青霉素是一种广谱半合成青霉素，抗菌谱与青霉素相似。现已被广泛应用于医药和农业中来治疗细菌感染。他可以有效的治疗很多细菌，例如:流感嗜血杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏杆菌等。然而在畜牧业中滥用氨苄青霉素造成的食品和农产品中的药物残留以及由于这些残留引发的疾病，如:过敏反应，呼吸困难和癫痫发作等。因此，确定食品及农产品中的氨苄青霉素的残留量已经变得至关重要。目前包括美国食品和药物管理局(FDA)，食品添加剂联合委员会(JECFA)，日本健康与福利等机构都建立了确定食品中氨苄青霉素是否超标的检测体系。
[0003]目前，主要用来检测氨苄青霉素的方法包括微生物法和高效液相色谱法(HPLC)。但是这两种方法都存在自身不可避免的缺点与限制。微生物分析法的特异性和灵敏度都比较低，而HPLC需要较为昂贵的样品预处理。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中氨苄青霉素的残留。
【发明内容】
[0004]为了解决以上现有技术中检测氨苄青霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器。
[0005]本发明是通过以下步骤得到的:
[0006]本发明中一共用到了 3条DNA链，其序列分别是:
[0007]HAP: 5’ -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3’
[0008]MB 探针:5，-Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，
[0009]捕获探针:5，-GTTCGCCCGC-SH-3，
[0010]其中发夹结构的序列HAP中，5’端画横线的部分为目标物氨苄青霉素的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密结合。由于该链两端的碱基是完全互补的，因此可以杂交形成稳定的发夹形二级结构。
[0011]MB探针的5’端修饰有亚甲基蓝，他可以一定的电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测该氧化还原信号来达到定量的检测目标物的目的。
[0012]捕获探针的3’端修饰有巯基(-SH)，可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将捕获探针固定在电极表面。
[0013]本发明中用到了两种酶:Phi 29 DNA聚合酶和Nt.AlwI内切酶。Phi 29 DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，核酸内切酶可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是:GGATCNNNNN，切割位点是最后两个碱基之间。
[0014]本发明中氨苄青霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过两步循环的方式来实现信号的放大，从而实现氨苄青霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
[0015]均相中发生的反应主要有:发夹结构的DNA中有目标物的适配体，在有目标物存在的情况下，该适配体序列能够特异性的识别目标物并与之结合，发生构型转变，从而将发夹结构的DNA链打开。此时均相中的MB探针就可以与打开的发夹结构的3’端发生互补配对，从而将MB探针与HAP固定到一起。此时在Phi 29 DNA聚合酶与dNTP的共同作用下，以发夹DNA为模板、以MB探针为引物发生链延长，最后长成一条完全杂交互补的双链，并释放目标物。此时目标物成游离的状态，并可进一步结合别的为打开的发夹结构，从而实现第一次循环放大，即目标物诱导的循环放大。在第二步循环放大中，利用了第一步产生的杂交双链，因为该链中含有核酸内切酶Nt.AlwI的识别切割位点，形成的双链可以被特异性的识别并切割，切断相邻两个碱基之间的磷酸二酯键。由于本发明中使用的聚合酶Phi29 DNA具有链置换功能。因此在聚合酶与dNTP的共同作用下，被核酸内切酶切割的链会以原有的链为模板，继续生长成新的杂交双链，从而替换下amplificat1n探针(酶切循环放大):5’-GTTCGCCCGC-3’单链。该酶切循环放大探针的序列与MB探针完全互补，因为可以形成杂交的双链。而经过链置换生成的新的双链中又包含了新的内切酶识别切割位点，从而继续新一轮的循环放大，即第二步的循环放大。
[0016]在均相反应中，两步放大的反应条件均为37°C，反应时间是2h。
[0017]一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器，在电极上依次修饰有捕获探针层、HAP和MB探针层；
[0018]捕获探针层中捕获探针:为5’ -GTTCGCCCGC-SH-3’ ；
[0019]HAP和MB探针层中含有HAP、MB探针、聚合酶、核酸内切酶和dNTP，
[0020]HAP 为 5， -GCGGGCGGTTGTATAGCGGTTTTTTTGGATCTTTTGTTCGCCCGC-3’
[0021]MB 探针为 5，-Methylene blue-GCGGGCGAAC-3，。
[0022]所述的生物传感器，捕获探针层的厚度大约为10±2nm、HAP和MB探针层的厚度约为15±2nm。
[0023]所述的生物传感器，HAP和MB探针层中HAP (摩尔)、MB探针(摩尔)、聚合酶(活性)、核酸内切酶(活性)和dNTP (活性)的摩尔与活性的比为I:1:250:250:250。
[0024]所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0025]( I)对电极进行预处理；
[0026]( 2 )将捕获探针层修饰到电极表面；
[0027](3 )将HAP和MB探针层修饰到电极表面。
[0028]所述的制备方法，优选将捕获探针层修饰到电极表面的操作步骤如下:将10 μ M的捕获探针1yL滴加到经过预处理的电极表面，在25°C下孵育2h。
[0029]所述的制备方法，优选将HAP和MB探针层修饰到电极表面的操作步骤如下:
[0030](I)将灭菌水，1X的buffer缓冲液、HAP和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h ；
[0031](2)向离心管中加入MB探针、聚合酶、核酸内切酶和dNTP，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h ；
[0032](3)将孵育好的混合溶液滴加到修饰好捕获探针层的电极上，将电极继续放在37 0C的恒温箱中孵育2h，清洗。
[0033]所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
[0034]所述的制备方法，优选所述电极为金电极。
[0035]该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将捕获探针固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后在37°C孵育2h使均相中的MB探针与电极表面的捕获探针完成杂交反应，从而将MB探针固定到电极表面。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为O到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。
[0036]本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有链置换功能的DNA聚合酶的链延伸和置换作用，核酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补氨苄青霉素现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
[0037]本发明的有益效果:
[0038]1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用氨苄青霉素的适体作为识别物质实现了对目标物氨苄青霉素的高特异性检测；
[0039]2、利用聚合酶的聚合作用，实现了目标物的循环利用，起到了信号放大的作用；
[0040]3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合聚合酶的链置换作用，实现了第二步循环放大。信号的两次循环放大实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；
[0041]4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
[0042]5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；
[0043]6、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
[0044]7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中氨苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用；
[0045]8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
【附图说明】
[0046]图1为该实验的原理图；
[0047]图2为实施例1 HAP浓度优化检测结果图；
[0048]图3为实施例2 MB探针浓度优化检测结果图；
[0049]图4为实施例3捕获探针浓度优化检测结果图；
[0050]图5为实施例4检测不同浓度目标物的DPV图；
[0051]图6为基于图5做的该生物传感器的工作曲线，该图的横坐标为目标物的浓度，纵坐标为检测的电流值；
[0052]图7为生物传感器结构示意图，其中I为金电极，2为捕获探针层，3为HAP和MB 探针层。
【具体实施方式】
[0053]下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0054]实施例1
[0055]电极修饰过程的主要步骤如下:
[0056]a、金电极首先在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；
[0057]b、将1yL的捕获探针(10 μ M)滴加到电极表面，在室温下(25°C )孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电