肌钙蛋白i、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检试纸条。
【背景技术】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌钙蛋白T(TnT)，肌钙蛋白C(TnC) —起，形成肌钙蛋白复合体，从而对细胞内钙离子信号的传递和肌动-肌球蛋白的相互作用起着极其主要的作用。急性心肌梗塞(AMI)发作后肌钙蛋白复合体分解，cTnl快速地释放入血液循环。尽管骨髂肌中也有肌钙蛋白I，但其氨基酸组成和cTnl不同，造成二者的免疫活性不同，进而保证了 cTnl测试的准确性。AMI症状发作后4-6小时cTnl才达到正常值上限，12-24小时后达到最高浓度，有时能维持6_10天。正常血清cTnl低于0.06ng/ml，有些AMI患者cTnl可高达I, 300ng/mlo与CK-MB相比，cTnl对心肌损伤的诊断敏感性更高，特导性更强，持续时间更长。因此cTnl测定对再发AMI的诊断尤其有帮助，还可诊断微小心梗，故对不稳定性心绞痛(UA)和非ST抬高的AMI的鉴别有极大帮助。
[0003]肌红蛋白(Myoglobin，ΜΥ0)是一种氧结合血红素蛋白，其分子量为16.7KD，主要分布于心肌和骨骼肌组织，呈紧密球形。因为肾衰时也可增高，其特异性就不很高(76%)。但由于分子量小，容易释放入外周血，在心肌损伤时能很快释放出来，是即时的最易检出的心肌坏死时的生化标志物，即在出现症状后的1-3小时就可见于血清中(敏感性60% )，其高峰为AMI后的3-6小时(敏感性90% )。由于其半衰期很短，故在较晚(6-8小时后)对AMI的诊断价值就很小。
[0004]肌酸激酶(Creatinekinase，CK)旧称为肌酸磷酸激酶(Creatinephosphokinase，CPK)。CK分子量为81000，由两个亚基组成。通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。CK在ATP参与下催化肌酸磷酸化，生成ATP和磷酸肌酸。肌酸激酶有四种同功酶形式:肌肉型(CK-MM)、脑型(CK-BB)、杂化型(CK-MB)和线粒体型(CK-MiMi)。CK-MM型主要存在于各种肌肉细胞中，CK-BB型主要存在于脑细胞中，CK-MB型主要存在于心肌细胞中，CK-MiMi型主要存在于心肌和骨骼肌线粒体中。
[0005]CK-MB在传统心肌酶学中曾作为诊断AMI的金标准，然而25% -50%的AMI患者在发病4小时内处于正常水平，造成约10%的患者被漏诊。CK-MB的心肌特异性较高，胸痛发生后4-6小时开始升高，但亦存在于骨骼肌中，骨骼肌损伤时增高。另正常人血中也存在，正常存在与病理性增加之间有交叉，敏感性不高，不能诊断微小心肌梗死。
[0006]综上所述，cTnl、ΜΥ0、CK-MB几种心肌标志物的临床诊断价值各不相同，如果单一检测某一项指标对AMI的检测是不够的。研究认为对cTnl、ΜΥ0、CK-MB这三种标志物联合检测，进行动态监测，有助于防止漏诊。在胸痛发作l_3h内MYO的检测优于cTnl，但在4-6h这三种标志物均具有较高的敏感性，因此对胸痛的患者进行cTnl、MYO和CK-MB三项指标的联合检测，对于AMI的早期发现有重要价值。研究结果显示，cTn1、MYO、CK-MB三合一联合检测的敏感性为96.6 %，特异性为95-8 %，提高了单一指标诊断AMI的敏感性和特异性。三者有效结合，对AMI的早期诊断和排除提供了更确凿的指标支持，提高了诊断的窗口期，为胸痛发作或临床可疑为AMI的病人作出正确和及时的诊断，进而为临床医师及时抢救和诊治病人提供了快捷有效的依据。
[0007]目前国内市场上检测产品并不多，均采用胶体金法，但检测灵敏度有一定的不足。
[0008]胶体金法:
[0009]该检测应用了胶体金技术，包括胶体金标记的单克隆抗体和非特异性的抗抗体。当患者的标本(如:血清)加入标本孔，金标单克隆抗体与标本中的cTnl/MYO/CK-MB结合，形成金标记的抗原抗体复合物。该复合物在反应膜上移动，与固定在膜上的抗抗体结合形成更大的复合物，复合物颜色深浅与cTnl/MYO/CK-MB的浓度成正比。
[0010]生物素-亲和素系统(b1tinavidin system，BAS)，是一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化，酶联免疫，荧光免疫，放射免疫等检测技术中，可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性，使方法更简便，有助于临床快速诊断，并利于进行大规模流行病学调查，成为研究免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速，又无放射物质污染，不需复杂仪器，充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。
[0011]生物素-亲和素系统检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达K^M1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素，因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素系统研制肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检快速诊断试剂尚无报道。
【实用新型内容】
[0012]本实用新型的目的，在于提供一种肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检试纸条，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统，提供高灵敏度肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检试纸条。使用本实用新型时，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，联合检测大幅度提高检测的准确性和便利性，检测时间不大于10分钟，大大提高了诊断效率。
[0013]本实用新型解决其技术问题的解决方案是:肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶定量联检试纸条，其包括底板，所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上，所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、生物素标记的肌红蛋白单克隆抗体、生物素标记的肌酸激酶同工酶单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别心肌肌钙蛋白I另外一个表位的单克隆抗体构成的第一检测线、识别肌红蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的第二检测线、识别肌酸激酶同工酶另外一个表位的单克隆抗体构成的第三检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
[0014]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条，所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
[0017]作为上述技术方案的进一步改进，所述观察窗为长方形孔。
[0018]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
[0019]作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
[0020]作为上述技术方案的进一步改进，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
[0021]作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
[0022]本实用新型与现有技术相比，具有如下优点:
[0023](I)本实用新型将荧光蛋白作为标记物，此标记物稳定性良好，有利于提高检测稳定性。
[0024](2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”，提高检测灵敏度，降低非特异性结合，有利于提高试剂盒性能。
[0025](3)利用本实用新型进行心肌肌钙蛋白1、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶的检测时间不大于10分钟，心肌肌I丐蛋白I检测线性范围为0.10ng/ml?30.00ng/ml，肌红蛋白检测线性范围为5.0ng/ml?500.0ng/ml，肌酸激酶同工酶检测线性范围为2.5ng/ml?200.0ng/ml，极大地提高了检测效率。
[0026](4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读，可实现自动化，减少主观因素的影响，提供便利、快速、可靠的诊断结果。
[0027](5)本实用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据分析仪器判定结果，准确可靠。
[0028](6)本实用新型制作方便，体积小、便于携带。
[0029](7)本实用新型检测成本较低。
[0030](8)本实用新型可批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速诊断；易于保存，有利于基层单位推广。
[0031](9)本实用新型采用联合检测，一条检测条同时检测三项，相对于三条检测条同时检测更加方便