定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用磁微粒化学发光技术和微流控芯片技术实现BNP高灵敏定量检测的方法，特别公开了一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，可实现全血中BNP的准确、高灵敏定量检测，属于微流控芯片化学发光免疫检测技术领域。
【背景技术】
[0002]脑钠肽是1988年日本学者TetsujiSudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽。大量基础和临床研究表明，血液中BNP水平在心力衰竭时显著升高，作为一种新的生物标记物，对心力衰竭的诊断、病程进展的监测、对疗效和预后评估有重要价值。
[0003]目前用于临床检测的BNP包括BNP和NT-proBNP两种。两者虽有相同生物学来源，但生物学效应和临床意义并不完全相同。心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体，该肽的一个信号肽(26个氨基)被立即去除，形成BNP前体(proBNP，108个氨基酸)，然后在内切酶作用下裂解为无生物活性的氮末端B型脑钠肽(NT-proBNP，76个氨基酸)和有活性的B型脑钠肽(BNP，32个氨基酸)ANP的清除主要通过与清除受体结合，而NT-proBNP主要由肾小球滤过，因此NT-proBNP血浓度受肾功能影响大于BNP。
[0004]BNP和NT-proBNP检测已经为各医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。
[0005]测定BNP的主要方法有化学发光法、免疫比浊法、免疫层析法(试纸条)和荧光芯片法等。化学发光法和免疫比浊法敏感高、准确，但需配套昂贵的大型仪器，检测时间长，并不适合急性诊断和小样本检测。免疫层析法虽简便快速，但灵敏度低、重复性差，易出现误判。荧光芯片法随较免疫层析法准确、灵敏度更高，但由于操作复杂，组分集成差，重复性并不尚O
[0006]中国专利201010139399.3描述了一种纳米微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒，采用纳米微球增强常规比浊法信号，实现对脑钠肽进行定量分析。
[0007]中国专利200720140931.7公布了一种脑钠肽颜色颗粒诊断试纸，采用颜色颗粒对脑钠肽进行定性检测。中国专利201310524436.6公开了一种同时检测人脑钠肤和N末端脑钠肤前体的快速定量检测装置及检测方法，采用胶体金免疫层析法配套相应仪器对试纸条进行定量检测。美国专利US60/576327和60/592202也对胶体金免疫层析检测进行了论述。但相比于化学发光检测，吸光度检测具有灵敏度低、线性范围窄、重复性差等缺陷。
[0008]中国专利200910077950.3描述了一种检测脑钠肤的光学生物传感器及试剂制备方法，采用毛细沟道，以磁颗粒和量子点分别标记抗体，形成双抗体夹心法检测脑钠肽。虽灵敏度提高了，但试剂组分集成差，操作复杂，重复性并不高。
[0009]针对现有脑钠肽检测方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化学发光法利用磁微粒化学发光的优势，在微流控芯片上集成所有试剂组分，可提供一种脑钠肽定量检测的磁微粒化学发光微流控芯片，对BNP进行快速准确定量检测。
【发明内容】
[0010]本发明要解决的技术问题为针对现有快速诊断方法灵敏度低、重复性差、受干扰明显，以及现有化学发光配套仪器昂贵、检测时间长的问题，提供一种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片(把除测试样本外所有组分均集成到芯片内)并配套小型便携设备，从而实现现场全血样本中BNP的快速、准确、高灵敏定量检测。
[0011 ]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为:
[0012]—种定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片由顶部胶带(12)、芯片基板(I)和底部胶带(15)构成，其中芯片基板(11)上过滤区
(2)、磁颗粒标记BNP抗体包被区(3)、反应区(5)、清洗区(6)、检测区(7)、液体释放通道(8)依次连接;芯片基板(11)上标记BNP抗体存储池(4)与反应区(5)连接，检测区(7)分别与清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)通过液体释放通道(8)连接，顶部胶带包含加样口
(13)、发光基底液和清洗液存储池让位孔(14);所述磁颗粒标记BNP抗体包被区(3)预封装包被磁颗粒标记BNP抗体;标记BNP抗体存储池(4)存储预封装酶或发光剂标记BNP抗体;清洗液存储池(9)和发光基底液存储池(10)分别存储预封装清洗液和发光基底液;所述微流控芯片测试流程中，用磁铁操控磁颗粒移动或聚集。
[0013]发光基底液存储池(10)也可以由发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)替代，发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)通过发光液预混合通道(18)连接。
[0014]具体地，本发明所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，其中磁颗粒尺寸和磁铁的磁感应强度对检测结果有明显的影响，磁铁颗粒尺寸为0.1?ΙΟμπι，磁感应强度500?30000高斯。
[0015]优选地，所述磁颗粒标记BNP抗体使用的磁颗粒为超顺磁性颗粒，包含三氧化二铁和四氧化三铁化合物，颗粒尺寸为0.5?3μπι，磁感应强度为1000?8000高斯。
[0016]具体地，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Proclin300的ρΗ7.4硼酸缓冲液;所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐温-20和Proclin30(^^pH7.4硼酸缓冲液。
[0017]具体地，所述酶或发光剂标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、吐温-20和Procl in300的pH7.4磷酸盐缓冲液;所述磁颗粒标记BNP抗体溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐温-20、曲拉通X-100和ProcIin300的pH7.4磷酸盐缓冲液。
[0018]具体地，所述发光基底液包含与酶对应的底物及发光增强液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A( 16)和发光基底液存储池B( 17)。
[0019]具体地，所述发光基底液包含发光剂对应的双氧水溶液和碱性溶液，可合并后注入发光基底液存储池(10)，或分别注入发光基底液存储池A( 16)和发光基底液存储池B
(17)。
[0020]具体地，本发明的芯片配套仪器为小型便携设备，包含挤压存储池，磁铁移动，发光检测系统等功能;芯片检测样本的体积为10?500μ1，优选20?ΙΟΟμΙ。更优选加样体积为50μ1ο
[0021]本发明提供的定量检测全血中脑钠肽的磁微粒化学发光微流控芯片是一种以化学发光为基础、在微流控芯片上实现脑钠肽快速、准确、高灵敏检测的新方法。
[0022]这种方法是将抗BNP抗体修饰酶，抗BNP抗体修饰在磁颗粒上，利用抗原抗体作用，如双抗体夹心法原理结合磁颗粒富集、化学发光检测样本中是否含有BNP，并准确分析其含量。
[0023]本发明脑钠肽定量检测的磁微粒化学发光方法及其微流控芯片能够解决现有化学发光技术中仪器昂贵、检测时间长的不足和缺陷，解决现有快速诊断方法灵敏度不高、重复性差的不足和缺陷。由于化学发光灵敏度高，其灵敏度是荧光检测方法的100倍以上。
[0024]本发明中所述酶，包含但不限于过氧化氢酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。发光基底液为酶对应的发光底物(如鲁米诺或金刚烷)和发光增强液(如苯衍生物等增强剂)，其中发光底物和发光增强液可合并，如图1所示混合均匀后注入一个发光基底液存储池(10);但当混合液保质期少于I年时应分开，如图4所示分别注入发光基底液存储池A(16)和发光基底液存储池B(17)，通过预混合通道(18)混合