本发明属于微机电微流控技术领域，具体涉及一种双注射器协同维持微流持续恒速的方法。
背景技术：
微流控(Microfluidics)指的是使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为纳升到阿升)的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。因为具有微型化、集成化等特征，微流控装置通常被称为微流控芯片，也被称为芯片实验室(Lab on a Chip)和微全分析系统(micro-Total Analytical System)。微流控的早期概念可以追溯到19世纪70年代采用光刻技术在硅片上制作的气相色谱仪，而后又发展为微流控毛细管电泳仪和微反应器等。微流控的重要特征之一是微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等。借助这些独特的流体现象，微流控可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。目前，微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景。除了有机合成、微反应器和化学分析等，微流控技术在生物医学领域发挥了越来越重要的作用。目前，两个重要的应用方向是临床诊断仪器和体外仿生模型。
在上述应用中，微流的流速恒定是众多微流控实验分析、细胞分析等的基础条件，为了精准控制微流，德国neMESYS仪器应运而生，目前，neMESYS仪器是世界上最先进的微流精准控制仪器，价格也比较昂贵，其主要功能在于可以实现微流的精准控制，该仪器组成包括一个硬件推送平台，平台上可设置多个注射器，平台通过一根USB线连接到一台普通的计算机，计算机上安装有neMESYS仪器的驱动程序和配套应用程序。通过操作计算机上的配套应用程序，可以使硬件推送平台上任何一个注射器推出恒速或变速的微流。但是尽管在单个注射器应用中可以保证微流恒速，却不能保证长时间，因为单个注射器推尽管内的微流后若还没达到满足需要的流量就无法持续了，为了解决持续流动问题，neMESYS仪器还提供了一种方法来实现双泵协同的持续流动(Continuous Flow)，其方法为，首先在该仪器的硬件推送平台上设置至少两个相同规格的注射器，然后在计算机操作界面中，对称设置两个注射器的速度和时间参数，并在配套应用程序中实现其中一个注射器的速度从V逐渐变化为-V时，另外一个注射器在同样的时间里，其速度从-V逐渐变化到V(假定V取正值时表示推送，那么V取负值时，则表示吸入)。当第一个注射器的推送速度逐渐减少时，而另一个注射器正处于吸入状态，其总输出微流的流速也呈现逐渐减少态，当第一个注射器推送停止即将转为吸入时，正好是第二个注射器开始由吸入转为推送，第一个注射器吸入速度从零逐渐增加最终达到-V，第二个推送速度从零逐渐增加最终达到V。由此可见，这种方法尽管实现了持续流动，却并不保证恒速，尤其存在着较大的切换脉动(switching impulses),微流恒速方面的误差较大，在单细胞流体观察分析实验的应用中，不能满足单细胞继续在动态液流环境中的继续受控的要求，导致单细胞在动态液流环境中从受控态迅速流失；并且该方法界面复杂，有较多的操作限制条件，不易使用，且采用该方法在注射器吸入时不能实现全速吸入。
一般情况下，在需要微流长时持续恒速时，实验员往往将两个注射泵放到一起，等到其中一个注射泵排空时，立即通过手工或电子的方式，启动另外一个注射泵，这样的方式，在切换时虽然可以做到微流恒有流动，却无法做到微流流速的恒定。尽管人眼可能看不出，但在微流世界里，会产生较大的切换脉动，不能保证无缝切换。其微流流速波动较大，尤其是单细胞流体观察分析实验中，在微流环境中抓控一个单细胞，完全通过水流、水压、气膜进行多通道控制，使得单细胞正好处在高速镜像仪的中间，此时，微流流速的人工或电子切换都无法满足恒速的条件，从而导致压力失衡，单细胞被微流冲走，丧失实验机会。因此，在这个特定环境中，需要精准控制微流流速，需要保证在微流切换时也能够维持流速恒定，避免已经抓控的细胞被冲走造成失控。而现有的电子或手工方式均不能很好的控制注射泵在切换时对微流流速恒定的维持。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服已有技术的不足之处，提出一种双注射器协同维持微流持续恒速的方法。本发明方法解决了已有微流流速控制中双泵切换存在较大的切换脉动、不能实现维持微流恒速的问题，具有很高的实用价值。
本发明提出的一种双注射器协同维持微流持续恒速的方法,其特征在于，主要包括两个相同规格注射器的协同控制交互，用户使用一台与neMESYS设备通过USB端口相连的计算机；该方法包括以下步骤：
1)neMESYS仪器初始化；
设置两个注射器的起始状态：使第一个注射器全速吸入溶液后停止；第二个注射器内溶液全部排空，达到协同前的起始状态：即第一个注射器状态为满，第二个注射器状态为空；用户指定设置在微流总输出管道中持续维持的微流速度为V立方米/秒,系统全速排空速度为Vmax立方米/秒,且Vmax≧2*V；假设注射器管的截面积为S平方米，则用户设定的微流速度的国际标准单位为(V/S)米/秒；假定第一个注射器是满的，容积为P立方米，则注射器液体长度L＝P/S米；
2)计算协同所需参数，包括两注射器协同推送距离比值SS、推送加速度绝对值A；
假设两个注射器协同推送的距离相等，在协同推送时，两个注射器的加速度绝对值相等，方向相反；具体计算步骤如下：
2-1)计算两注射器协同推送距离比值SS；
协同推送距离比值SS，是协同推送距离占注射器液体长度L的比值；设一个注射器从SS比值处，SS<1，开始第一次协同推送，则第二次的协同推送距离比值为1-SS-V/Vmax,即两次推送协同距离比值分别为SS和1-SS-V/Vmax；令两次协同推送距离比值相等，均为(SS+1-SS-V/Vmax)/2＝0.5-0.5*V/Vmax；
根据用户指定的微流流速V，计算得到协同推送距离比值SS如式(1)所示：
SS＝0.5-0.5*V/Vmax (1)
代入注射器液体长度L＝P/S米，则协同推送距离如式(2)所示：
(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S (2)
单位为米；
2-2)计算两注射器的推送加速度绝对值均为A立方米/秒2：
转换为国际标准单位的加速度a后，表达式如式(3)所示：
a＝A/S (3)
单位为米/秒2
根据加速度公式，从速度v匀减速变化到0，则满足物理学公式如式(4)所示：
a＝v2/2s (4)
式中，v代表速度，单位为米/秒；s代表距离，单位为米；
将步骤1)得到的用户设定的微流速度的国际标准单位速度值V/S代入式(4)中的v，将协同推送距离(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S代入s,得到：
a＝(V/S)2/[2*(0.5-0.5*V/Vmax)*(P/S)]
＝V2/[(1-V/Vmax)*P*S] (5)
联立式(3)和(5)，得到：
V2/[(1-V/Vmax)*P*S]＝A/S (6)
消去等式两边S,得到注射器容积P和用户设定的微流速度V计算得到推送加速度绝对值A，如式(7)所示：
A＝V2/[(1-V/Vmax)*P] (7)
单位为立方米/秒2；
3)两注射器协同推送启动时，状态为满的第一个注射器以用户指定微流速度V开始推送，同时状态为空的第二个注射器以全速排空速度Vmax开始全速吸入，吸满后等待；在第一个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度L的比值等于协同推送距离比值SS时，两个注射器开始第一次协同推送；
4)第一个注射器速度开始由用户指定微流速度V以匀减速度A推送，直到速度降到0，当第一个注射器速度降为0时，推送到注射器底部，推送结束，并立即从推送状态变为吸入状态；进入吸入状态后，第一个注射器以全速排空速度Vmax开始全速吸入，吸满后等待；
5)在第一个注射器开始匀减速的同时，第二个注射器开始由吸满等待状态进入推送状态，从速度为0以匀加速度A推送,直到达到用户指定微流速度V，并之后以该微流速度V继续推送；在第二个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度L的比值等于协同推送距离比值SS时，这两个注射器的状态条件与上一次协同推送启动时的状态条件正好相反，两个注射器开始下一次协同推送；转入步骤4)，如此循环进行，直到推送的溶液达到用户设定的所需溶液为止。
本发明提出的一种双注射器协同维持微流持续恒速的方法，其特点及有益效果在于：
本发明在neMESYS仪器硬件和计算机基础上开发出了实现长时间微流的自动控制程序，实现了在自动交替加载控制过程和溶液切换过程中，能够始终维持微流溶液推送速度的恒定，解决了双泵切换中不能维持微流恒速的问题：在两个单泵注射器切换中，克服了切换脉动造成的影响，并在实际应用的单细胞抓取实验中，成功维持恒速在一定误差内，使得细胞抓取未受双泵切换影响，从而解决了微流体流动环境中单细胞的长时间观察分析、药物实验、饲养等实际应用问题。
具体实施方式
本发明提出的一种双注射器协同维持微流持续恒速的方法,下面结合具体实施例进一步详细说明如下。
本发明方法采用的设备及其连接关系说明如下：本发明基于neMESYS仪器，其组成包括一个硬件推送平台，平台上至少配有2个相同规格的注射器，平台通过一根USB线连接到一台普通的计算机，计算机上安装有neMESYS仪器的驱动程序和实现本发明方法的双注射器协同维持微流持续恒速方法的控制程序，该程序由普通编程人员使用C#语言编制而成，该计算机显示器上设置有本方法的操作界面。
两个相同规格的注射器安装在neMESYS仪器的硬件推送平台上，引出的两个输出的微流管，通过一个二合一管连接在一起，形成一个微流总输出管道，输出至显微镜和高速摄像机下的微流控制芯片中。引出的两个输入的微流管则各自插入一个独立容器的含有待观察细胞的溶液中。
本发明的双注射器协同维持微流持续恒速的方法，包括以下步骤：
1)neMESYS仪器初始化；
设置两个注射器的起始状态：使第一个注射器全速吸入溶液后停止；第二个注射器内溶液全部排空，达到协同前的起始状态：即第一个注射器状态为满，第二个注射器状态为空；用户指定设置在微流总输出管道中持续维持的微流速度为V立方米/秒,系统全速排空速度为Vmax立方米/秒,且Vmax≧2*V；假设注射器管的截面积为S平方米，则用户设定的微流速度的国际标准单位为(V/S)米/秒；假定第一个注射器是满的，容积为P立方米，则注射器液体长度L＝P/S米；
2)计算协同所需参数，包括两注射器协同推送距离比值SS、推送加速度绝对值A；
本方法包括两个注射器端点附近的协同推送，两个注射器协同推送的距离相等；在协同推送时，这两个注射器的加速度绝对值相等，方向相反；设注射器液体长度为L，具体计算步骤如下：
2-1)计算两注射器协同推送距离比值SS；
协同推送距离比值SS，是协同推送距离占注射器液体长度L的比值，因此，实际协同推送距离等于协同推送距离比值乘以注射器液体长度L(设一个注射器从SS比值处(SS<1)开始第一次协同推送，则第二次的协同推送距离比值为1-SS-V/Vmax,即两次协同推送距离比值分别为SS和1-SS-V/Vmax，为了均衡优化起见，本实施例让两次推送保持相同的推送距离，以更利于微流流速的稳定。)因此，两次协同推送距离比值相等，均为(SS+1-SS-V/Vmax)/2＝0.5-0.5*V/Vmax；
由于全速排空速度Vmax为系统设定值，则根据用户指定的微流流速V，计算得到协同推送距离比值SS如式(1)所示：
SS＝0.5-0.5*V/Vmax (1)
协同推送距离如式(2)所示：
(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S (2)
单位为米；
2-2)计算两注射器的推送加速度绝对值均为A立方米/秒2：
转换为国际标准单位的加速度a后，表达式如式(3)所示：
a＝A/S (3)
单位为米/秒2
根据加速度公式，从速度v匀减速变化到0，则满足物理学公式如式(4)所示：
a＝v2/2s (4)
式中，v代表速度，单位为米/秒；s代表距离，单位为米；
将步骤1)得到的用户设定的微流速度的国际标准单位速度值V/S代入式(4)中的v，将协同推送距离(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S代入s,可得：
a＝(V/S)2/[2*(0.5-0.5*V/Vmax)*(P/S)]
＝V2/[(1-V/Vmax)*P*S] (5)
联立式(3)和(5)(由于式(3)和式(5)都是表示同一个加速度a,可得：
V2/[(1-V/Vmax)*P*S]＝A/S (6)
(此时，由于同一注射器截面积S都是相同的，因此)消去S,根据注射器容积P和用户设定的微流速度V计算得到推送加速度的绝对值A如式(7)所示：
A＝V2/[(1-V/Vmax)*P] (7)
单位为立方米/秒2；
3)两注射器协同推送送启动时，状态为满的第一个注射器以用户指定微流速度V开始推送，同时状态为空的第二个注射器以全速排空速度Vmax开始全速吸入，吸满后等待；在第一个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度L的比值等于协同推送距离比值SS时，两个注射器开始第一次协同推送；
4)第一个注射器速度开始由V以匀减速度A推送，直到速度降到0，当第一个注射器速度降为0时，推送到注射器底部，推送结束，并立即从推送状态变为吸入状态；进入吸入状态后，第一个注射器以全速排空速度Vmax开始全速吸入，吸满后等待；
5)在第一个注射器开始匀减速的同时，第二个注射器开始由吸满等待状态进入推送状态，从速度为0以匀加速度A推送,直到达到用户指定微流速度V，并之后以该微流速度V继续推送；在第二个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度L的比值等于协同推送距离比值SS时，这两个注射器的状态条件与上一次协同推送启动时的状态条件正好相反，两个注射器开始下一次协同推送；转入步骤4)，注意第一个注射器和第二个注射器的动作和上一次协同时的动作正好相反(因为状态条件正好相反)，如此循环进行，直到推送的溶液达到用户设定的所需溶液为止。如果中途需要更换溶液，则在某注射器开始推送时开始更换，在该注射器推送完毕之前必须先完成溶液更换。
下面结合一个具体实施例对本发明进一步详细说明如下：
本实施例应用于对微流体流动环境中单细胞的长时间观察分析，包括以下步骤：本实施例的neMESYS设备是指，德国CETONI公司生产的注射泵仪器产品组成的硬件推送平台，这是本发明所依赖的基础物理设备。该公司网址为：
http://www.cetoni.de/english/company.html
还包括在平台上配有2个相同规格的注射器，平台通过一根USB线连接到一台普通的计算机，计算机上安装有neMESYS仪器的驱动程序和实现本实施例双注射器协同维持微流持续恒速方法的控制程序，该程序由普通编程人员使用C#语言编制而成，该计算机显示器上设置有本方法的操作界面。
本实施例中的微流是指，微流控领域中的微小流体(体积为纳升到阿升)。
其中计算机一方面具备和neMESYS设备交互的接口，另外一方面具备和用户交互的人机界面，它具体包括设备驱动层、设备推送控制层、设备通讯层、数据信息转换层、人机交互层，对neMESYS设备的直接控制主要通过设备驱动层进行。
本实施例方法包括以下步骤：
1)neMESYS仪器初始化；
设置两个注射器的起始状态：使第一个注射器全速吸入溶液后停止；第二个注射器内溶液全部排空，达到协同前的起始状态：即第一个注射器状态为满，第二个注射器状态为空；本实施例用户指定设置在微流总输出管道中持续维持的微流速度为2毫升/秒，即V＝2*10-6米3/秒,系统全速排空速度为4毫升/秒，即Vmax＝4*10-6米3/秒,且Vmax＝2*V；注射器管的截面积为S＝5厘米2＝0.5*10-3平方米，用户设定的微流速度的国际标准单位为V/S＝4*10-3米/秒＝4毫米/秒；当注射器容液是满的，容积为P＝80毫升＝0.08升＝0.08*10-3米3，则注射器液体长度L＝P/S＝0.16米＝16厘米；
2)计算协同所需参数，包括两注射器协同推送距离比值SS、推送加速度绝对值A；
本方法包括两个注射器端点附近的协同推送，两个注射器协同推送的距离相等；在协同推送时，这两个注射器的加速度绝对值相等，方向相反；具体计算步骤如下：
2-1)计算两注射器协同推送距离比值SS；
协同推送距离比值SS，是协同推送距离占注射器液体长度L的比值，因此，实际协同推送距离等于协同推送距离比值乘以注射器液体长度L(设一个注射器从SS比值处(SS<1)开始第一次协同推送，则第二次的协同推送距离比值为1-SS-V/Vmax,即两次协同推送距离比值分别为SS和1-SS-V/Vmax，为了均衡优化起见，本实施例让两次推送保持相同的推送距离，以更利于微流流速的稳定。)因此，令两次协同推送距离比值相等，均为(SS+1-SS-V/Vmax)/2＝0.5-0.5*V/Vmax；
由于全速排空速度本实施例为Vmax＝4*10-6米3/秒，则根据用户指定的微流流速V，本实施例为V＝2*10-6米3/秒，计算得到协同推送距离比值SS如式(1)所示：
SS＝0.5-0.5*V/Vmax＝0.5-0.5*2/4＝0.5/2＝0.25 (1)
本实施例中注射器液体长度L＝P/S＝0.16米，则协同推送距离如式(2)所示：
(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S＝0.25*0.16＝0.04(米) (2)
2-2)计算两注射器的推送加速度绝对值均为A立方米/秒2：
转换为国际标准单位的加速度a后，表达式如式(3)所示：
a＝(A/S)米/秒2 (3)
根据加速度公式，从v匀减速变化到0，则满足物理学公式如式(4)所示：
a＝v2/2s (4)
式中，v代表速度，单位为米/秒；s代表距离，单位为米；
将步骤1)得到的用户设定的微流速度的国际标准单位速度值V/S代入式(4)中的v，将协同推送距离(0.5-0.5*V/Vmax)*P/S代入s,可得：
a＝(V/S)2/[2*(0.5-0.5*V/Vmax)*(P/S)]
＝V2/[(1-V/Vmax)*P*S] (5)
联立式(3)和(5)(由于式1和式2都是表示同一个加速度a,)可得：
V2/[(1-V/Vmax)*P*S]＝A/S (6)
(此时，由于同一注射器截面积S都是相同的，因此)消去S,根据注射器容积P和用户设定的微流速度V计算得到推送加速度的绝对值A如式(7)所示：
A＝V2/[(1-V/Vmax)*P]＝0.1*10-6米3/秒2＝0.1*10-3升/秒2＝0.1毫升/秒2 (7)；
3)两注射器协同推送启动时，状态为满的第一个注射器以用户指定微流速度V＝2毫升/秒开始推送，同时状态为空的第二个注射器以全速排空速度Vmax＝4毫升/秒开始全速吸入，则第二个注射器20秒吸满后等待；在第一个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度的比值等于协同推送距离比值SS为0.25时(此时第一个注射器已经推送了60毫升，还剩20毫升，协同推送距离为0.04米)，两个注射器开始第一次协同推送；
4)第一个注射器速度开始由V＝2毫升/秒以匀减速度A＝0.1毫升/秒2推送，直到速度降到0，此时(协同时间为20秒)第一个注射器刚好推送到注射器底部(第一个注射器推送距离＝0.5at2＝0.5*[0.1*10-6/(0.5*10-3)]*202＝0.5*0.2*10-3*400米＝0.04米，等于协同推送距离，推送了20毫升，因此刚好到达底部)，立即从推送状态变为吸入状态；进入吸入状态后，第一个注射器以全速排空速度Vmax＝4毫升/秒开始全速吸入，20秒后吸满后(80毫升)等待；
5)在第一个注射器开始匀减速的同时(推送距离剩余20毫升时)，第二个注射器开始由吸满等待状态进入推送状态，从速度为0以匀加速度A＝0.1毫升/秒2推送,直到达到用户指定微流速度V＝2毫升/秒(此时，加速时间刚好20秒时，第二个注射器推送20毫升)并之后以该微流速度V＝2毫升/秒继续推送(继续推送时用时20秒，匀速推送40毫升，这个时间与第一个注射器的吸满所需时间20秒相等，也就是说第二个注射器匀速结束时，第一个注射器刚好吸满)；在第二个注射器推送的剩余距离与注射器液体长度L的比值等于协同推送距离比值SS为0.25时(此时，第二个注射器剩余推送距离为20毫升，而第一个注射器刚刚吸满，这两个注射器的状态条件与上一次协同推送启动时的状态条件正好相反，两个注射器开始下一次协同推送；转入步骤4)，此时协同时，第一个注射器和第二个注射器的动作和上一次协同时的动作正好相反(因为两者状态条件正好相反)，如此循环进行，直到推送的溶液达到用户设定的所需溶液为止。如果中途需要更换溶液，则在某注射器开始推送时开始更换，在该注射器推送完毕之前必须先完成溶液更换。
本实施例方法可以完成如下应用实验：在动态微流恒速环境下，利用液流动态平衡控制，抓取一个癌症单细胞，进行微量药物实验，观察癌症细胞对药物的反应，并且可以在微流恒速环境下对同一个受控细胞进行药物溶液切换的连续长时间实验。