用于胎儿和母体红细胞计数的系统和方法
【专利说明】用于胎儿和母体红细胞计数的系统和方法
[0001]本申请要求享有2012年9月13日递交的美国临时专利申请申请号为N0.61/700, 659的优先权，此专利申请以引用的方式全部并入本文。
技术领域
[0002]本发明主要涉及用于细胞分析的图像处理领域，尤其涉及用于区分和计数胎儿和母体红细胞的系统和方法。
【背景技术】
[0003]在北美，每年有超过600万次的妊娠。新生儿Rh血型不合溶血病是一种严重的同种免疫情况，胎儿红细胞(RBCs)经胎盘由母体免疫系统破坏。在妊娠期间或分娩过程中，少数胎儿的红细胞可进入母体的血液循环。如果母体为Rh阴性，而胎儿为Rh阳性时，母体的身体会产生对抗Rh抗原的抗体(IgG)。这个过程被称为致敏过程。最常见的，致敏过程在分娩时(约85%的致敏病例)发生，但胎儿的血液也可在妊娠时较早地进入母体循环(约15%的致敏病例)(参见 J.M.Bowman and J.M.Pollock, “Rh-1mmunizat1n duringPregnancy and Grandmother Theory,，，Journal of Pediatrics, vol.93, pp.313-314，1978)。在此期间或以后妊娠过程中IgG能够通过胎盘进入胎儿体内，从而引起Rh阳性胎儿红细胞的破坏。
[0004]所有妊娠的白种人中有约1/10是一个Rh阴性妇女怀着一个Rh阳性婴儿的情况，其中13%的Rh阴性母亲是致敏的(参见A.S.Prasad, EcL，Acquired hemolyticanemias.1n: Bick RL, ed.Hema to logy: Clinical and Laboratory Practice.St.Louis: Mosby-Yearbook, Inc., 1993)0除了造成贫血，胎儿-母体出血可能对胎儿造成如神经系统损伤、死胎或新生儿死亡的灾难性后果(B.J.Wylie and Μ.E.D’Alton,“Fetomaternal hemorrhage” Obstet.Gynecol., Vol.115, pp.1039-51，2010)。许多存活下来的婴儿也会有严重疾病。诊断和治疗需要确定胎儿-母体出血量(即，已经进入母体循环的胎儿血液量)，这通常实施于Rh-阴性母体，用以确定药物的所需剂量，使用Rho(D)免疫球蛋白(RhIg)以抑制母体内Rh抗体的形成并防止Rh-阳性幼儿将来发生Rh血型不合溶血病。
[0005]除Rh血型不合溶血病外，胎儿-母体出血也可以由胎儿和母体循环之间的正常生理屏障完整性缺乏而引起，此时也必须在妊娠监护时定量以方便及时治疗(例如，输血)(C.J.Chen, S.N.Cheng, C.M.Lee, F.ff.Chang, C.C.ffu, and Y.S.Yuh,“Fetomaternal hemorrhage,” J.Med.Sc1., Vol.23, pp.231-34，2003)。量化胎儿-母体出血的标准临床方法是Kleihauer-Betke (KB)试验(Z.Y.Wang, J.ff.Shi,Y.L.Zhou, and C.G.Ruan, “Detect1n of red blood cell-bound immunoglobulin Gby flow cytometry and its applicat1n in the diagnosis of autoimmune hemolyticanemia,” Interna t1nal Journal of Hematology, vol.73, pp.188—193， 2001)。试验利用胎儿与母体血红蛋白对酸耐受的差异性(胎儿血红蛋白耐受更显著)。由母体血液制备标准血涂片(PBS溶液1:1000稀释)。经干燥、染色和孵育后，血涂片切片由通过认证的技术人员在显微镜下计数。由于胎儿血红蛋白对柠檬酸盐缓冲液耐受，得到的亮粉色细胞被归类为胎儿细胞。然后可以计算出胎儿-母体出血的百分比。
[0006]KB试验的重要组成部分，是胎儿与母体红细胞的计数。目前这种计数由经过培训的技术人员通过显微镜目镜计数并至少人工完成2000个细胞。人工计数大约需要15分钟，同时存在固有的不一致性和不可靠性。
[0007]虽然文献有记载术语“自动检测胎儿红细胞”，但是并没有对自动计数胎儿和母体红细胞的方法的记载，也没有对区别这两种细胞的方法的记载。文献中已经记载的工作中(参见 D.M.V Pelikan, ff.E.Mesker, S.a Scherjon, H.H.H.Kanhai, and H.J.Tanke, “Improvement of the Kleihauer-Betke test by automated detect1n of fetalerythrocytes in maternal blood,，， Cytometry.Part B，Clinical cytometry, vol.54, n0.1, pp.1-9, Jul.2003 以及 D.M.Pelikan, S.a Scherjon, ff.E.Mesker,G.M.de Groot-Swings, G.G.Brouwer-Mandema, H.J.Tanke, and Η.H.Kanhai,“Quantificat1n of fetomaternal hemorrhage: a comparative study of the manualand automated microscopic Kleihauer-Betke tests and flow cytometry in clinicalsamples, ” American journal of obstetrics and gynecology, vol.191, n0.2, pp.551-7，Aug.2004)，这些工作过程中的自动化是指使用商业化的机械载物台采集细胞图像。图像先用绿色滤光器采集，然后经由红色滤光器的第二次扫描再次被采集。因此，图像采集需要使用装有绿色吸收滤光器和红色吸收滤光器的显微镜。技术人员基于染色的强度和分布型态从母体红细胞中区分胎儿红细胞。在KB切片中的细胞总数也是人工估算的。
[0008]图像处理方法已经被开发用于其它类型细胞的计数，但还未用于计数红细胞。在一项研宄中(参见 N.Bandekar, A.Wong D.Clausi and M.Gorbet, “A novel approachto automated cell counting for studying human corneal epithelial cells,，，Intn，I Conf.1EEE EMBS, Boston, pp.5997-6000, 2011)，细胞计数是通过非最大抑制和种子区域生长以分割聚集的角膜上皮细胞来进行的。尽管如此，这种算法只应用灰度和空间信息，使得它难以检测血影细胞和分割那些聚集的细胞。在另一项研宄中，霍夫圆形转换被用于自动计数培养瓶中细胞集落(参见J.M.Bewes et al., “Automated cellcolony counting and analysis using the circular Hough image transform algorithm(CHiTA), Phys.Med.B1l., Vol.53，pp.5991-6008，2008)。强度梯度和圆形霍夫转换被用来区分集落边缘和检测细胞。在这些严重重叠的细胞欠分割不可避免的情况下，使用这种方法定量低浓度的细胞集落是有效的。此外，污染物不能在计数结果中剔除。
[0009]现有技术的专利包括CellVis1n 公司的 US6341180、US7327901 和 US7835077 ；和 Nextslide Imaging 公司的公开专利 US2011/0170760、Nexcelom B1science 公司的US2010/0189338,B1-RadLaboratories 公司的 US2012/0314092。后述三者与本发明相关。
[0010]Nextslide Imaging公司的US2011 / 0170760 “临床血液学的网络图像检查”，公开了建立基于互联网的数据库进行细胞数字成像分析的方法。用户通过因特网上传细胞图像，并且所述图像在远程服务器上进行处理。其并未公开细胞计数的方法。
[0011]CellaVis1n AB公司申请的专利号为7835077的专利，“包括有平台定位装置的显微镜系统”，公开了一个屈曲系统以调整样本的垂直位置，从而保持样本在聚焦位置。
[0012]由B1-Rad Laboratories公司申请的“细胞计数系统和方法”，如在US2012/0314092中公开的，介绍了使用样本的数字图像计数细胞数量的系统。装载有一份细胞的样品装载器可被插入系统的对应槽位，并且系统具有能自动调整样品装载器相对位置的运动机制。在样本装载器的转动和平移过程中采集不超过三个图像。样品上的大部分区域会被遗漏使得计数准确度并不可靠。此外，该系统仅适用于低细胞浓度的样品的测试。
[0013]因此，现有技术没有公开用于计数和区分母体和胎儿红细胞的自动地且能充分地定性的方法或系统