MALDI质谱方法与流程

本发明涉及一种用于分析分析物的maldi质谱方法，包括以下步骤：

-提供包含分析物、基质材料、用于所述基质材料的溶剂的测试组合物；

-由所述测试组合物产生液滴，所述液滴被喷射到流路中，所述流路的长度足以实现溶剂的蒸发和基质材料在分析物上沉淀，从而获得试样；

-验证每个试样含有预定数量的分析物；

-对试样进行电离以获得电离组分，

-通过飞行时间质谱仪检测所述电离组分，和

-根据检测到的电离组分鉴定所述分析物。

本发明还涉及一种可以执行所述方法的maldi质谱仪仪器。

本发明还涉及基质材料在进行maldi质谱方法中的用途。

背景技术：

maldi质谱法是一种强大的分析方法，用于检测分析物，尤其是生物来源的分析物，例如蛋白质、细胞、微生物(例如细菌等)。在本文中maldi是基质辅助激光解吸电离的缩写。这表明分析物与基质材料结合在一起。在分析物和基质材料结合的下游，使用激光对样品进行电离。通过质谱法检测电离组分。

通常，在maldi板上提供maldi样品。激光选择maldi板上的点进行电离。然而，在maldi板上提供大量的分析物，这妨碍了检测。很容易的是，不止一种类型的细胞存在于maldi板上。maldi质谱法的替代实施方案从气溶胶开始。气溶胶可以是存在于气体流(gasstream)中的气溶胶，例如ep1342256b1和ep2210110b1中所公开的。可选地，可通过雾化由液体组合物产生气溶胶。

后一种气溶胶方法的实例从d.h.russell等人，journalofmassspectrometry，第31期(1996)，第295-302页获知。测试的蛋白质是牛胰岛素、缓激肽乙酸盐和马的心脏肌红蛋白。将这些蛋白质与基质材料一起溶解在溶剂中。溶剂是添加有至多30％的水的醇。基质是4-硝基苯胺和α-氰基-4-羟基肉桂酸(hcca)，其是众所周知的maldi基质材料。雾化在真空下实现以产生由于蒸发被冷却的液滴，并形成重液甚至冰粒。然后通过与加热的干燥管中的气体碰撞使颗粒升温，在加热的干燥管中颗粒的尺寸继续减小且颗粒破碎。发生基质和蛋白质分析物的共结晶。但是，此方法每次测量不使用单一分析物。更特别地，分析物不是细胞的，而是可以与基质材料一起溶解在溶剂中。

与其提供气溶胶，更巧妙的是提供液滴的流。然后，可以光学验证每个液滴均含有预定数量的细胞分析物。优选的数量是一个，尽管其他有限的数量也是可行的，例如多达10个细胞分析物，适当地1至5个，例如2或3个。通过限制每个样品的分析物数量，鉴定分析物变得更加容易；即，所得谱图的任何部分来自样品内的哪个分析物不会有任何歧义。为简便起见，将此方法称为“单颗粒maldt”，而没有任何希望排除每个样品中存在不止一个细胞的选项。

wo2010/021548公开了其测试组合物的制备。首先，将给定样品用溶剂或水稀释以获得预定密度。之后，以期望的浓度添加基质材料以获得测试组合物。随后，借助于压电谐振器，例如喷墨印刷设备，由测试组合物产生液滴的流(或束)。在此也可以进行颗粒检测，以确定液滴中存在一个微生物。在wo2010/021548中公开的方法中，颗粒检测是通过荧光进行的，并且优选在添加基质材料之前进行，以防止基质结晶阻碍检测来自微生物的荧光。

在使用maldi质谱方法进行的实验中，发现许多所得的谱图不含有用于鉴定分析物的足够强的特征。通常，在maldi中，例如在单颗粒maldi中，将来自各个试样的多个质谱叠加，以获得更好的信噪比和识别微生物的特征。根据其信噪比，将结果称为特征丰富或特征贫乏。关于负面的、特征贫乏的结果，证实所有微生物都被一层maldi基质包覆。进一步证实所有试样均含有微生物。

技术实现要素：

因此，本发明的一个目的是提供一种用于检测分析物(诸如微生物)的改进的maldi质谱方法，所述分析物以悬浮液形式提供，且其中所述检测方法是特征丰富的，从而能够进行鉴定。

因此，本发明的另一个目的是提供一种maldi质谱仪器。

本发明的另一个目的是提供适用于maldi质谱方法并能够产生特征丰富的谱图的测试组合物的用途。

根据第一方面，本发明提供了一种maldi质谱方法，包括以下步骤：

-提供包含细胞分析物、基质材料、溶剂和用于基质材料的水性反溶剂的测试组合物，其中所述测试组合物是分析物的悬浮液，其中所述溶剂的挥发性高于所述反溶剂的挥发性，并且其中所述反溶剂相对于所述溶剂过量存在；

-由所述测试组合物产生液滴束，所述液滴具有20至70μm，优选30至60μm的直径并被喷射到流路中，所述流路的长度足以实现溶剂和反溶剂的蒸发以及基质材料在细胞分析物上沉淀，从而获得试样，其中所述测试组合物和液滴直径实现试样的非球形颗粒形态；

-任选地，基于表示试样的颗粒形态的形态参数选择要分析的试样；

-对任选选择的试样进行电离以获得电离组分，

-通过飞行时间质谱仪检测所述电离组分，和

-根据检测到的电离组分鉴定分析物。

根据第二方面，本发明提供了一种maldi质谱仪器，包括(1)液滴产生设备，用于产生液滴束并设有用于包含细胞分析物、溶剂、反溶剂和基质材料的测试组合物的容器；(2)管状腔室，位于所述液滴产生设备的下游且包括长度足以实现溶剂和反溶剂的蒸发以及基质材料在分析物上沉淀从而获得试样的流路；(3)传感装置，用于测量腔室内的试样的参数；(4)飞行时间质谱仪；(5)电离装置，用于选择性地电离待由质谱仪检测的试样，和(6)处理器，用于基于感测参数选择试样并用于基于质谱仪检测到的电离组分鉴定分析物。本文中，传感装置被配置为用于测量表示试样的颗粒形态的形态参数，且处理器被配置为用于识别试样的形态并基于所识别的形态选择用于电离的试样。

根据第三方面，本发明提供了测试组合物用于对分析物进行maldi质谱分析的用途，所述测试组合物包含基质材料和有机溶剂以及水性反溶剂，基质材料溶解在所述溶剂中。所述测试组合物被配置为与细胞分析物混合，然后被喷射为具有20-70μm，优选30-60μm的液滴直径的液滴束，从而在流路中实现基质材料在细胞分析物上的结晶，具有结晶的基质材料的细胞分析物具有基本上非球形的形状。另外，所述基质材料包括芳族环、至少一个能够氢键键合的官能团和c1-c8-烷基链，优选c1-c4烷基链。所述基质材料在反溶剂中的溶解度为至多2mg/ml，优选至多1mg/ml，更优选至多0.5mg/ml。所述溶剂具有比反溶剂更高的挥发性，并且有机溶剂和水性反溶剂以0.03(1:33)至0.33(1:3)，优选0.05(1:20)至0.25(1:4)范围内的质量比存在。

本发明是基于以下见解：当试样的产生涉及结晶时，特别是产生板状或针状晶体时，产生特征丰富的谱图。在引向本发明的研究中使用现有技术的基质材料检测到，基质材料以主要为非晶态形式沉淀在细胞分析物上。当试样形成为几乎单分散的颗粒时，随后的电离和质谱分析(例如通过离子质量分离)不会产生特征丰富的谱图，而是产生基本上不含任何信息的谱图。然而，当改变试样的制备以确保在细胞分析物上形成基质材料的晶体时，特征显著增强。

本发明人在引向本发明的研究中发现，添加反溶剂不仅促进了结晶，而且所形成的晶体还具有明显的纵向形状。这种更明显的形状被认为是由于更快地达到了所需的过饱和水平而导致更长的结晶持续时间所引起的。此外，鉴于明显的形状，由于使用过量的水，基质材料以不同的晶体形式结晶，更具体地以水合物形式结晶。特别地，形成板状晶体，其中该晶体部分地从微生物(或其他细胞)延伸。在某些情况下，微生物(或其他细胞)似乎并未被完全覆盖。

其中晶体从微生物或其他细胞表面延伸的这种晶体形式的形成甚至更令人惊讶，因为它发生在空气中。由于液滴是自由飞行的并且非常小，因此可以预期形成基本上球形的试样。这确实是现有技术中所发生的。然而，在本发明中，形状基本上偏离球形形状，且偏离地如此之多以至于所得到的颗粒的形状差异可以用作检测的原理。

通过向测试组合物中添加过量的水性反溶剂并形成具有预定直径的液滴来实现该结晶。结果，在将液滴喷射到流路中之后，特别是由于溶剂的蒸发，基体材料会很快在测试组合物中达到其饱和极限。更特别地选择有机溶剂以使其比反溶剂更易挥发。以此方式，更快地实现了液滴相对于基质材料的过饱和，导致更明显的结晶。然后，基质材料将结晶到细胞分析物上。合适地，基质材料在水性反溶剂中的溶解度为至多2mg/ml，优选至多1mg/ml，更优选至多0.5mg/ml或甚至至多0.3mg/ml。在本文中，溶解度定义为室温下的固有溶解度。这通常经由计算机模拟(insilico)定义。其被正式定义为在分子没有解离的状态下的溶解度。优选地，在25℃在ph2的实验条件下也满足所述溶解度极限。更优选地，基质材料在反溶剂中具有有限的溶解度，例如至少0.01mg/ml，例如至少0.05mg/ml的溶解度。

根据本发明，水性反溶剂相对于溶剂过量存在。在引向本发明的实验中，已经发现溶剂与水之间的质量比在0.03(1:33)至0.33(1:3)的范围内是合适的。该比例取决于基质材料，取决于可用于蒸发和结晶的流路以及取决于发生蒸发的温度和其他物理条件。优选地，质量比在0.05(1:20)至0.2(1:5)的范围内，进一步优选高达0.125(1:8)，例如1:9，例如10％的水和90％的乙醇。尽管认为在室温下进行蒸发和在先的液滴产生是可行的，但不排除改变该温度。合适的温度范围例如为15至50℃，优选为20至40℃。

使用水作为反溶剂的另一个优点是水可以结合到晶体中，从而形成水合物形式的晶体。所得的晶体可以是任何合适的水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物或甚至更高级水合物的形式。在基质材料的结晶中形成针状物和板状物表明了水合物的形成。这种形成显然是可以实现的，原因在于溶剂首先蒸发并且过量的水随时间增加，从而导致水的可利用性。水合物可以是一水合物、二水合物、三水合物、半水合物(0.5)、四水合物、五水合物或任何其他水合物。不排除板状物和针状物构成不同的水合物晶体。

在一个实施方案中，水性反溶剂是纯水。在另一个且优选的实施方案中，反溶剂是酸化的水，例如酸化至ph在0至5，优选1至4范围内的水。所述水性反溶剂可以是技术人员已知的与质谱兼容的盐溶液。合适地，盐浓度为至多1mm。这样的盐更优选地含有可以分解并变得可挥发的化合物，以便蒸发并防止盐结合到晶体中。如本领域技术人员所知，常规的盐(例如碱金属盐)结合到晶体中会使maldi质谱测量无效。

在优选的实施方案中，溶剂是有机溶剂，例如醇、链烷酮(酮或醛)、醚、氰基取代烷烃、乙酸烷基酯。有机溶剂合适地基于c1-c5烷基链，更优选c1-c3烷基。优选地，有机溶剂的极性不是太低，这使得基质材料具有适当的溶解度且分析物具有适当的分散性。此外，适当的极性使得溶剂可与反溶剂混溶。例如，所述溶剂可以具有至少2.0，更优选至少3.0，或甚至至少3.5或至少4.0的由极性指数p’表示的极性。该极性指数p’是由l.r.schnyder(参见l.r.snyder,“classificationofthesolventpropertiesofcommonliquids”,j.chromatogr.sci.,1978,16,223-234)定义的。更特别地，溶剂具有大气压下低于90℃或优选低于85℃的沸点。溶剂的最优选实例包括丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、2-甲氧基乙醇、正丙醇、异丙醇。

在优选的实施方案中，基质材料包括芳族环、至少一个能够氢键键合的官能团和c1-c8-烷基链，优选c1-c4烷基链。已经发现基质材料的结构特征的这种组合具有所期望的性质的组合。如本领域中已知的，芳族环，其可以是杂环，作为生色团官能团的一部分是有关的。由此，激光可以有效地被吸收以实现电离。另外，芳族环与烷基链一起有助于疏水性，导致在水性反溶剂中的低溶解度。能够氢键键合的官能团例如选自硫醇、醇基、酸基、胺基。这使得能够与细胞分析物的细胞壁中的蛋白质氢键键合。

在一个实施方案中，所述基质材料选自以下组：

这里x是n、s或o，并且其中r¹和r²独立地选自氢、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基，并且它们中的至少一个不是氢。优选地，基质材料是噻唑或咪唑化合物。使用噻唑化合物已获得了良好的结果。实例包括5-乙基-2-巯基噻唑、3,4-二甲基-2-巯基噻唑、6-氨基-2-巯基噻唑、6-乙氧基-2-巯基噻唑。优选的实例是3,4-二甲基-2-巯基噻唑和5-乙基-巯基噻唑。这类材料本身已知用于maldi质谱法，例如从xu等人,j.am.soc.massspectrom8(1997),116-124获知。xu等人将测试组合物很好地沉积在样品板上，然后干燥。在这种情况下，通常在测试组合物和板的表面之间的界面处发生结晶，从而形成均匀的晶体。

在另一实施方案中，基质材料选自任选氰基取代羟基取代肉桂酸的组的c1-c8烷基酯的组。实例是α-氰基-4-羟基肉桂酸的甲基酯、乙基酯、丙基酯和丁基酯，和2-氰基-4-羟基肉桂酸的甲基酯、乙基酯、丙基酯和丁基酯以及芥子酸的酯。其他常规基质材料(例如2,5-二氢苯甲酸)的酯也是可行的。

在另一实施方案中，将结晶促进添加剂添加到测试组合物中。这种添加剂优选包含疏水性颗粒。其实例是可商购的石墨烯薄片。疏水性颗粒合适地具有纳米范围内的厚度，例如具有小于100nm或优选小于50nm，或甚至小于25nm的厚度，并且具有高达几微米的直径。认为有利的是，以使每个液滴配给单个颗粒的量添加该疏水颗粒。本发明人认为，添加结晶促进添加剂降低了开始结晶所需的过饱和(也称为过度饱和)程度。本文中，所添加的颗粒充当结晶核。由于纳米范围内的厚度，等效的空气动力学直径适当地为至多约几微米，例如小于3μm。它们不会干扰形态参数的任何进一步测量。

本发明中的液滴束借助于诸如基于压电谐振器的液滴分配器产生。该液滴分配器具有规定了期望的液滴直径的出口管，即喷嘴。使用20-70μm，例如30-60μm范围内的液滴获得了良好的结果。甚至更优选的是30至45μm范围内的液滴直径。太大的液滴具有污染的风险，这可能会影响质谱测量。细胞分析物通常具有约1至2微米的尺寸。液滴直径为100μm时，单个细胞分析物和初始液滴之间的有效比率为近乎10⁶。那么，ppm范围内的污染可以影响测量。当减小液滴直径时，初始液滴与最终颗粒之间的比率迅速降低。对于约30μm的液滴，该比率为约3.10⁴。液滴尺寸的下限由所需基质材料的量定义，因为基质材料的浓度在液滴喷射前不应超过饱和。

在本发明的上下文中，使用频闪寻址led(“频闪led”)以500hz的频率和5μs的持续时间光学测量液滴直径。使用数码相机，例如基于ccd图像传感器的数码相机进行评估。借助于具有频率为500hz的压电谐振器的液滴分配器产生液滴。该方法更详细地描述于k.thurow等人,journalofautomatedmethodsandmanagementinchemistry,vol2009,article198732,doi:10.1155/2009/198732中，其通过引用并入本文。

此外，观察到所要求保护的液滴直径范围确认了可行的液滴直径。一旦已经针对该范围内的特定液滴直径校准了液滴分配器，则液滴直径将具有良好地在所述范围内的公差误差，例如至多5微米或甚至至多2微米的误差(标准偏差)。

在一个优选的实施方案中，选择步骤包括评估测试颗粒是具有非球形颗粒形态还是具有至少基本上球形的颗粒形态。将理解并在附图中示出的是，具有球形颗粒形态的测试颗粒不需要是完全球形的。基于该评估，仪器将选择具有非球形颗粒形态的测试颗粒进行电离。这是通过控制器特别安排的。不排除的是，具有非球形颗粒形态的测试颗粒只有一部分被电离。如本领域中已知的，通过激光器适当地进行电离。如将在下文中解释的，存在用于感测形态参数的若干实施方案。除了感测形态参数之外，该方法可以包括光学检测分析物在液滴中的存在的步骤。这种光学检测可以与感测形态参数同时进行。可选地，可以在其上游进行，例如在产生液滴时进行。然后可以将不含生物材料的液滴喷射到通往废物容器的另一流路中。

此外观察到，除了基本上非球形的颗粒之外，仍可以形成球形颗粒。这是由于溶剂和水之间的质量比的非均匀性，还可能是因为其他无法控制的过程，例如分析物对水的吸收。鉴于此，根据本发明的一个方面，认为合适的是执行试样的选择，以便选择性地电离具有非球形形状的那些试样。该选择包括感测步骤，以感测表示颗粒形态的形态参数并基于其结果执行该选择。

初步研究表明，非球形试样在空气动力学直径方面以及在空气动力学直径的标准偏差方面不同于球形试样。通常，球形试样的空气动力学直径显著更大，例如大至少10％，更特别地大至少20％。在一种实施方式中，非球形试样(包括晶体材料)的空气动力学直径为约1.0-2.0μm，而球形试样(包括非晶材料)为约2.5μm。空气动力学直径的标准偏差甚至更加不同：对于球形试样，试样相对于光学检测装置的相对方位不会导致直径的很大变化，在这个意义上来说，该偏差较小。这使得球形颗粒的空气动力学直径可预测，使得可以将非球形颗粒与之区别开。对于非球形试样，该偏差要大得多，即，空气动力学直径随相对于光学检测装置的方位变化而变化。考虑到结晶度的差异，形态的另一种实施方式是预定波长的辐射的反射率；晶体将产生更明显的入射辐射的反射率。

附图说明

将参考附图进一步阐明本发明的这些方面和其他方面，其中：

图1示出了用于maldi质谱的仪器的示意图，其中对液体测试组合物进行优选预处理，以及

图2示出了图1的仪器内的颗粒流路和质谱仪的示意图。

图3示出了液滴发生器和包括发生蒸发和结晶的流路的腔室的示意图；

图4示出了根据本发明一个实施方案制备的多个试样的sem图像；

图5示出了不含分析物的结晶基质材料的sem图像；

图6a示出了图4中所示的多个试样的空气动力学直径特征的图；

图6b示出了图4中所示的多个试样的质谱图；

图7a和图7b示出了图4中所示的非球形颗粒的部分的空气动力学直径和质谱图；

图8a和图8b示出了图4中所示的球形颗粒的部分的空气动力学直径和质谱图；

图9示出了根据本发明的另一实施方案制备的多个试样的sem图像，其中测试组合物还包含结晶促进添加剂；

图10a和图10b示出了图9所示的试样的空气动力学直径和质谱图；

图11示出了根据现有技术制备的试样的sem图像；

图12示出了根据现有技术的试样的maldi质谱图。

具体实施方式

这些图未按比例绘制。不同附图中的相同附图标记指代相同或相应的特征。

图1示出了用于maldi质谱的仪器的第一实施方案的示意图。图2更详细地示出了仪器的部分200，在下文中也称为飞行路径单元200。maldi质谱特别适用于生物材料的鉴定。一种优选的生物材料类型是微生物，例如细菌、真菌和病毒。可以用maldi鉴定的其他类型的生物材料包括例如血细胞、肽。一种特定形式的maldi是单颗粒maldi，其中单个试样(例如液滴)含有一个或有限数量的单个生物有机体。有限数量例如是至多10个，优选地至多5个，进一步优选1至3个。然而，最优选地，进行单颗粒maldi使得每个试样中存在一个微生物。

该仪器包括样品接收器10、导管11、第一混合单元12、第二混合单元14和飞行路径单元200。飞行路径单元包括干燥室15、电离室191和飞行时间管194。液滴通过任何液滴喷射器16(诸如例如基于压电谐振器的液滴喷射器)进行喷射。液滴跟随从干燥室15延伸到飞行时间管194中的液滴束24。在干燥后，液滴束24实际上被转换为粒子束192。在被来自脉冲激光器18的辐射电离后，粒子束192被转换成离子束195。质谱仪(未示出)测量离子束195的离子并基于其创建谱图。根据本发明的一个实施方案，利用传感器20、传感器22确定形态参数，以选择被脉冲激光器18的激光脉冲电离的颗粒。

第一混合单元12包括第一混合器120，用于溶剂和/或反溶剂(例如水)的容器122，以及检测器124。并非一个容器122，可以存在两个单独的容器。在第一混合器120中用溶剂和/或反溶剂稀释例如从患者获得的样品材料。检测器124适当地是光学检测器，其被配置为当微生物流过测量光束时检测从各个微生物散射的光。根据每单位时间间隔平均检测到的微生物计数可以确定密度。这种检测器124本身是已知的，并且例如是血细胞计数器或流式血细胞计数器。示出了颗粒检测器124连接到第一混合器120的控制输入。控制机构被布置成增加溶剂和/或反溶剂的量，直到所测量的密度下降到预定密度或低于预定密度。优选地，两者以预定比例添加。可以使用液体循环回路来循环组合物直到达到所需的密度。第二混合单元14包括第二混合器14和基质材料储存器142。基质材料储存器142连接到第二混合器140。第二混合器14被配置为将基质材料混合到从第一混合单元12获得的测试组合物中。

液滴发生器16可以设置有用于评估液滴是含有单个微生物还是任何其他数量的微生物的装置。可以布置这种检测装置以在通过喷嘴喷射之前观察通道中的悬浮液。所述发生器16还可以设置有用于根据从检测装置获得的信息将喷射的液滴引导到第一位置或第二位置的装置。那么，第一位置是目标位置，即流路朝向该位置，在该位置处，激光源可以将辐射射在颗粒上以使其电离。第二位置是废物位置。引导装置被配置成用于使液滴或机动平台偏转，该机动平台被配置成用于引导喷嘴。这样的仪器本身从ep2577254b1是已知的，并且通过引用被包括于本文中。

在操作中，将包含来自样品接收器10的分析物、来自第一混合单元12的溶剂和反溶剂以及来自第二混合单元14的基质材料的液体的流分成多个部分，每个部分形成穿过腔室15飞行发射的小液滴。在飞行穿过干燥室15的过程中，液滴中的基质材料在分析物(通常是微生物)上结晶，同时液滴在飞行中干燥，从而得到干燥的颗粒，该颗粒也称为试样。通常，液滴以30至60μm范围内的直径被发射。在第一实施方案中，干燥颗粒的空气动力学直径小于3.0μm，其中试样含有单个细菌。如果干燥颗粒根据本发明结晶，而不是如现有技术中那样为非晶形式，则在第一实施方案中，干燥颗粒的空气动力学直径甚至更小，通常为约1至2μm。由于液滴的小尺寸，在飞行过程中只需要很少的时间来制备用于电离的液滴。随后，从脉冲激光器18向干燥颗粒发射激光脉冲。这导致来自试样的材料电离。电离的材料在质谱仪中被检测。与之连接的处理器处理所获得的数据，以生成可以与已知数据集进行比较的谱图或数据集。该已知数据集通常存储于库中。

通过确定形态参数来实现液滴的感测。在本实施例中，如下文所述，传感器感测颗粒的空气动力学直径和/或其标准偏差。这通过第一检测通道20和第二检测通道22来实现，每个通道均包括光源和检测器。第一检测通道20的光源可以是任何类型的，例如是可见光源和紫外线辐射源。第二检测通道22的光源最优选地是可见光源，例如是任何合适波长的发光二极管。在一个实施方案中，光检测器是光电倍增管。

虽然第一检测通道20可以使用具有uv范围内的波长(诸如266nm)的激光设备，但是这需要使用荧光检测器。然而，荧光具有较低的灵敏度，需要更灵敏的检测器。此外，荧光检测器需要至少两个检测通道，一个用于荧光，一个用于可见光的散射，包括滤光器。此外，需要两个激光器，其中紫外激光器需要高功率。总而言之，这构成了昂贵且复杂的检测器，当使用可见光时可以避免这种情况。利用两个可见光检测通道，则单个激光器和分束器就足够了。

图3更详细地示出了液滴发生器16的出口和腔室15。在该图中，液滴通过腔室15的流路可以具有竖直方向。由于小的液滴尺寸，已经发现，液滴很快(即在流路的最初几厘米处)达到恒定速度。该速度是重力和空气动力学阻力的平衡。腔室15设置有控温壁，以保持腔室中的温度恒定。在一个实施方案中，选择22至30℃的温度。腔室15还设有用于产生均匀分布的鞘流的气体的入口。所述气体包括例如空气或氮气，并且相对于水蒸气和任选地任何溶剂或助溶剂蒸气的浓度进行控制。适当地，控制水蒸气浓度以使相对湿度为30％或更高。鞘流将液滴传输至气溶胶飞行时间质谱仪的入口。

因此，总的来说，本发明的maldi质谱方法包括提供测试组合物，该测试组合物包含分析物、基质材料、用于基质材料的溶剂和反溶剂，该组合物有助于在液滴产生后基质材料在分析物上的结晶。由于结晶，获得了试样的非球形颗粒形态。通过感测形态参数，可以将具有非球形颗粒形态的试样与具有至少基本上球形颗粒形态的试样区分开。根据感测结果，选择具有非球形颗粒形态的试样进行电离和质谱分析。反溶剂例如是水，溶剂是有机溶剂。在一个实施方案中，所形成的晶体是以水合物形式结晶的。

实施例

实施例1(对比)

由溶解在1:1的水-乙腈混合物中的表皮葡萄球菌细胞和作为基质材料的α-氰基-4-羟基肉桂酸(αchca)的悬浮液制备测试组合物。αchca在水中的溶解度为6mg/ml。因此，水不是αchca的反溶剂。借助于液滴发生器产生其液滴。如参照图1-3所述，液滴在飞行过程中被干燥。如图11所示，形成了几乎单分散的颗粒，其构成试样。图11是在philips电子显微镜上在100kpa的压力、4.00kv的电压下制备的sem图像。这些颗粒含有覆盖有干燥基质的非晶层，位于中心的细胞。电离后，进行质谱分析。产生的谱图如图12所示。显然没有获得特征。

实施例2(发明)

在约25℃的温度和约30％的相对湿度下，10/90(体积/体积)的乙腈/水混合物中的大肠杆菌细胞含有约300ppm(w/w)的2-巯基-4,5-二甲基噻唑。获得了板状结晶颗粒和球形非晶颗粒。图4是颗粒的sem图像，其中两种类型的颗粒均清晰可辨。除了板状晶体颗粒外，还可以观察到针状晶体。为了识别图4中可见的各种颗粒，测定了空气动力学直径和质谱。结果示于图6、图7和图8(a)和图8(b)中。图6(a)、图7(a)和图8(a)示出了空气动力学直径。图6(b)、图7(b)和图8(b)示出了相应的质谱图。

在图6(a)和图6(b)中，示出了所有颗粒的结果。显然，存在空气动力学直径的显著变化，具有强峰。虽然图5(a)中未显示比例，但最强峰的峰位置对应于2.8μm。

图7(a)和7(b)示出了非球形颗粒的结果。示出了空气动力学直径的显著变化，并且获得了特征丰富的质谱图。

图8(a)和图8(b)示出了球形颗粒的结果。空气动力学直径的感测导致具有相当有限宽度的峰。但是，质谱图的特征非常贫乏，根本不允许进行任何形式的鉴定。

用各种细菌和其他微生物重复该实施例的实验。不管采用何种细胞分析物，均获得了良好的结果。此外，在一系列实验中，过量的水发生变化，表明使用有机溶剂与水之间的不同于10/90的另一体积比，例如30/70也可获得良好的结果。

实施例3

单独进行基质材料2-巯基-4,5-二甲基噻唑的结晶。通过在水和乙醇的混合物中洗涤合成后获得的基质材料，然后在真空炉中干燥获得晶体。结果如图5所示。

实施例4

制备进一步包含可商购的石墨烯薄片的另外的测试组合物。使该测试组合物经受本发明的方法。制备试样的sem图像，如图9所示。显然，相对于使用实施例2中使用的测试组合物而言，球形颗粒的数量已经急剧下降。

图10(a)示出了空气动力学直径的分布，显示相对较宽的分布。图10(b)示出了与图7(b)的质谱图基本对应的质谱图。