亚群的制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨相关间充质干细胞，具体涉及骨相关间充质干细胞Scal+亚群的制备及应用。
【背景技术】
[0002]骨龛的组成复杂多样，包含了多种细胞成分、细胞外基质成分、氧气张力生长因子、细胞因子，以及维持微环境的PH、离子强度、代谢物等物理化学因素。骨相关间充质干细胞(bone-associated MSC)是骨龛的组分细胞之一，其具有多种分化潜能，在不同的诱导条件下，骨相关间充质干细胞可以发育为骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
【发明内容】
[0003]本发明提供的骨相关间充质干细胞Scal+亚群的制备方法包括:利用抗-⑶45抗体、抗_Terll9抗体和抗-Scal抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Scal+亚群。
[0004]本发明同时还提供了骨相关间充质干细胞Scal+亚群用于治疗肿瘤相关性贫血的应用。
[0005]本发明还提供了骨相关间充质干细胞Scal+亚群制备缓解急性移植物抗宿主病的应用。
【附图说明】
[0006]图1为流式细胞仪鉴定骨相关间充质干细胞Scal+亚群分选纯化的结果。
[0007]图2为分选的骨相关间充质干细胞Scal+亚群，⑶271 +亚群和SSEA4-1 +亚群体外培养5d后检测细胞增殖结果，显微镜放大倍率为400 X。
[0008]图3为骨相关间充质干细胞Scal+亚群支持造血重建结果；图A为技术路线示意图；图B为克隆形成分析结果；图C为骨髓移植后1-4月HSC重建形成分析，a图为HSC重建分析；b图为T细胞重建分析；c图为髓系细胞重建分析；d图为B细胞重建分析。
[0009]图4为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)小鼠生存曲线比较结果。
[0010]图5为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)的长骨比较。
[0011]图6为骨相关间充质干细胞Scal+亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)小鼠外周血检测结果比较；图八为外周血中红细胞计数；图B为外周血中红细胞压积；图C为外周血中血红蛋白的浓度；图中*代表显著性差异程度，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001 ；ns代表没有显著差异。
[0012]图7为骨相关间充质干细胞Scal+亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)小鼠的骨髓中红系细胞发育检测，图A为流式检测图，图B为数据统计分析图。
[0013]图8为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(MSC)和亚群治疗组(Seal)的生存曲线比较结果。
[0014]图9为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Scal)的临床评分比较结果。
【具体实施方式】
[0015]造血微环境(Niche)这一概念在1978年由Schofield首先提出。这是一种从低等动物到哺乳动物都存在的造血调控模式。多项研宄证实，Niche是调控HSC生理功能的主要功能单位，是HSC的维持和调控依赖的特定细胞微环境。Niche内的多种细胞可通过产生细胞因子，或者细胞直接接触的方式，去调控HSC的自我更新、多向分化和不对称分裂。如Niche内Wnt信号的非经典成员Flamingo和Frizzled分子之间的相互作用，直接参与维持HSC的稳态；抑制Wnt信号同时活化mTOR信号，体内外均可有效维持HSC ；内皮细胞来源的Notch受体能促进LT-HSC的增殖；Niche来源的Hedgehog信号参与维持HSC，腺苷脱氨酶信号则可以对抗Hedgehog对HSC的调控作用。目前认为Niche主要有血管龛和骨龛两种经典的结构。血窦内皮龛除了定位于骨髓以外，还存在于肝脏、脾脏等具有血窦结构的器官内；骨龛仅位于骨髓。骨龛通过其构成细胞产生的各种造血相关细胞因子或者信号分子对HSC的增生分化、发育、成熟、迀移、定居、释放、凋亡等活动产生直接影响作用，从而实现对HSC生物学行为的调控。
[0016]作为Niche的重要组成部分，骨相关MSC不仅对HSC生理功能的调控过程起到了重要作用，而且对各系细胞，尤其是免疫细胞，如T细胞、树突细胞、DC细胞等的分化发育都起到了调节作用。但是骨相关MSC是多种类型细胞组成的混合群细胞，其功能与MSC的来源、分离纯化技术、分选标记都有密切关系。
[0017]肿瘤相关性贫血(cancer related anemia, CRA)是恶性肿瘤常见的并发症之一，能显著影响临床治疗效果和肿瘤患者生存期。CRA发生的本质是实体肿瘤发生时，红系细胞发育分化的过程异常，导致患者外周血中单位容积内红细胞计数、血红蛋白浓度或红细胞压积异常，即临床症状为贫血。目前临床上CRA的治疗方案主要是采用对症治疗、输血治疗、重组EPO以及铁剂补充等方法。这些治疗方法能暂时改善患者贫血的临床症状，但是并不能完全从根本上治疗CRA。同时这些治疗方法本身还存在一定局限性与副作用。因此如果能够从根本上，即从影响红系细胞的生成发育过程的因素对CRA进行治疗，可能会大大提高CRA的治疗效果。造血微环境是调控红系生成发育的重要因素之一，而骨相关MSC作为其重要组成部分，也参与了红系生成发育得调控。因此以其作为CRA治疗的靶向目标，不仅能从根本上对CRA起到治疗作用，同时还会减低CRA的复发率，最终提高肿瘤患者的生存治疗。
[0018]造血干细胞移植是治疗血液恶性疾病的有效途径，然而并发症移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的发生成为阻碍造血干细胞移植成功的主要原因。接受异体移植物的受体发生急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease, aGVHD)的概率是50%，其中不到20%的人移植后能存活超过5年，尤其是抗固醇类aGVHD能导致90 %的致死率。目前，临床上采用多种细胞治疗方法预防或治疗GVHD，其中包括不同来源的MSCs。但是目前诱导移植免疫耐受时多使用MSCs混合群，而MSCs亚群众多，功能差异较大，为了使MSCs在临床上得到更好的应用，需要探索MSCs各细胞亚群在免疫耐受诱导中的作用以及机制。
[0019]发明人意外地发现，将从小鼠胫骨、股骨上得到的骨相关MSC利用发明人独创的分选标记对其进行分选鉴定，获得了较高纯度的Scal+亚群细胞。
[0020]发明人意外的发现，上述获得的Scal+亚群细胞可以在体外培养并增殖；并且参与支持造血重建。
[0021]发明人利用分选得到的Scal+亚群细胞对CRA模型小鼠进行治疗，发现治疗后的模型小鼠外周血贫血症状被纠正，同时改善了骨髓中红系前体细胞发育异常的情况；且治疗效果比混合群细胞明显。
[0022]发明人利用分选得到Scal+亚群细胞对aGVHD小鼠模型进行治疗，发现治疗后的模型小鼠aGVHD临床症状有所改善，生存时间延长；且治疗效果比混合群细胞明显。
[0023]实施例1.骨相关间充质干细胞制备
[0024]1、取小鼠股骨和腔骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，放于研磨杯内研磨至骨髓释放，分离收集骨髓待用。加入PBS冲洗骨头，再次研磨和冲洗，直到骨头全部变成白色;
[0025]2、用吸水纸吸干残余PBS，加入0.5 %胶原酶(3mg/mL, Sigma, Ronkonkoma, NY, USA)混勾后，摇床上 37°C消化 Ih ；
[0026]3、取60 μ m孔径滤网，过滤消化后骨混合物，收集虑过液，1500rpm离心5min后弃上清;
[0027]4、向上述细胞沉积中加入适量红细胞裂解液，室温静止2min，加入过量的PBS后，1500rpm离心5min，弃上清，获得细胞沉积即为骨相关间充质干细胞。
[0028]实施例2.骨相关间充质干细胞亚群细胞制备
[0029]1、骨相关间充质干细胞Scal+亚群的制备
[0030]1.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒(easysep mouse select1n kit, Stem Cell Ltd.Vancouver, Canada)要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。
[0031]1.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5min后弃上清。
[0032]1.3 在 20 μ I 流式缓冲液中加入抗-CD45(30-F11, B1legend, California, USA)，抗-Terll9(17-5921，eB1science, San Diego, USA)，抗-Seal (E13-161.7, B1legend, California, USA)流式抗体，混勾。
[0033]1.4将上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8°C染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300 μ I流式缓冲液，流式仪上机分选骨相关间充质干细胞Scal+亚群，结果如图1所示。
[0034]2、骨相关间充质干细胞⑶271+亚群细胞的制备
[0035]2.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。
[0036]2.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5min后弃上清。
[0037]2.3在20 μ I流式缓冲液中加入抗-⑶45，抗-Terl 19，抗-⑶271流式抗体，混匀。
[0038]2.4将上述预混的流式抗体加入到所得的细胞沉积中，2-8°C染色20min，流式缓冲液重悬后1500rpm离心5min，细胞重悬于300 μ I流式缓冲液，流式仪上机分选⑶271+亚群细胞。
[0039]3、骨相关间充质干细胞SSEA4+亚群细胞的制备
[0040]3.1将得到骨相关MSC细胞转入5mL试管中并计数，然后按照磁珠分选试剂盒要求加入适量的分选缓冲液以及标记缓冲液、磁珠。按照磁珠分选试剂盒操作要求进行细胞分选。
[0041]3.2将分选得到的细胞计数，取适量细胞转入流式管中，1500rpm离心5min后弃上清。
[0042]3.3在20 μ I流式缓冲液中加入抗-CD45，抗-Terl 19，抗-SSEA4流式抗体，混匀。
[0043]3.4将