花生维生素E合成相关基因AhPK及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及花生维生素E合成相关基因及其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用。
【背景技术】
[0002]维生素E是一种脂溶性的小分子抗氧化剂，分为生育酚和生育三烯酚两类，各包括α-、β-、γ-和δ-四种类型，其中以α-生育酚的活性最高，可以被人和动物高效吸收和利用。维生素E具有酚氧基结构，在植物光合组织中可使逆境胁迫产生的活性氧自由基失活，并通过与膜脂水解产物形成复合物，清除类囊体膜上的脂质过氧化产物，阻止膜脂过氧化的扩大，保护膜的完整性，从而增强植株的抗逆境胁迫能力。在非光合组织中，维生素E能淬灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂质免受单线态氧损伤；还可以被超氧阴离子自由基氧化，使不饱和油脂免受自由基攻击，从而抑制油脂的自动氧化，延长油脂的贮存期。另外维生素E还具有调节脂肪酸合成、糖类运输、茉莉酸和乙烯信号转导，促进种子萌发等功能
维生素E主要在高等植物的叶绿体内膜上合成，储存于植物的叶片和种子中，尤其是油料植物的种子。维生素E合成的第一步是前体一尿黑酸(HGA)和植基二磷酸(I3DP)的合成。其中PDP形成维生素E的疏水尾部，它可由栊牛儿基栊牛儿基二磷酸(GGDP)还原而成；也可由GGDP在聚合酶的作用下与叶绿素A聚合成栊牛儿基栊牛儿基叶绿素A，后者由栊牛儿基栊牛儿基二磷酸还原酶(GGR)催化生成叶绿素A，叶绿素A在叶绿素酶的作用下脱去植醇，生成脱植基叶绿酸A，而植醇在植醇激酶的作用下形成植基一磷酸，之后生成rop。
[0003]植醇激酶是影响维生素E含量的关键酶之一，它可催化植醇向植基一磷酸的生成，进而合成生育酚的前体H)P。Valentin等在拟南芥中发现一个突变体，维生素E含量只有野生型的20%，并通过图位克隆法得到了相关基因VTE5(PK)，该基因编码植醇激酶。在集胞藻中敲除VTE5的同源基因slrl652后，相应突变体中维生素E含量减少了 50%。而且进一步研宄发现，在集胞藻和拟南芥叶、种子中积聚的大多数和生育酚合成中有关的PDP来自于植醇。目前通过遗传转化可使油料作物的生育三烯酚含量提高10-15倍，而生育酚含量最多只能提高2-2.5倍。很多学者认为，这种差异主要是由于PDP库的供给不足。而植醇激酶和绿色植物中rop的合成有着密切的关系，因此它可能是维生素E生物合成途径中的一个限速酶，它的活性会直接影响维生素E的总体含量和活性。
【发明内容】
[0004]本发明提供了花生维生素E合成相关基因其在提高植物维生素E含量和耐盐性中的应用，本发明将4??基因在花生中过量，可以显著提高转基因植株的维生素E含量、活性和种子的耐盐性。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现: 花生维生素E合成相关基因AhPK,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0006]所述基因4??有6个外显子，分别对应的碱基分别为第34-366、1316-1378、1498-1631、2011-2128、2270-2384、2685-2863 位。
[0007]克隆所述基因引物名称与序列如下:
Pl:5 ; - ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3 '；
P2:5 ; - TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 '；
所述引物序列分别与4??基因第1-25碱基、第2857-2881碱基对应。
[0008]本发明提供了所述的花生维生素E合成相关基因4^/%编码产生的蛋白质，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2所示。
[0009]本发明还提供了所述的花生维生素E合成相关基因4^/%在提高植物维生素E含量中的应用。
[0010]进一步的，所述基因转入花生中超量表达，能提高转基因花生植株叶片的维生素E含量，维生素E含量中生育酚总量达到对照的2.81倍，活性最高的α生育酚含量达到对照2.8倍。
[0011]本发明还提供了所述的花生维生素E合成相关基因^^%在提高植物耐盐性中的应用。
[0012]进一步的，将花生因在花生中超量表达，花生转基因种子在0.7% NaCl溶液中发芽率最高可达到40%。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
1、本发明从花生中克隆了基因(JA/无测序结果表明该基因有6个外显子，分别对应的碱基为 34-366，1316-1378，1498-1631，2011-2128，2270-2384，2685-2863。并对其进行了功能验证。
[0014]2、将基因转入花生中获得的转基因花生植株形态发育正常，其生育酚总量和活性最高的α生育酚含量均明显增加，所以可以证明本发明将4??基因在花生过量表达可显著提高叶片维生素E中生育酚和α生育酚含量。
[0015]3、因经实验证明受盐胁迫诱导表达，48h时可达到对照的224倍。
[0016]4、转基因花生种子在0.7% NaCl的发芽率最高可达到40%，而非转基因种子的发芽率只有15% ;本发明将4??基因在花生过量表达可显著提高种子的耐盐性。
[0017]本发明以花生这一重要的油料作物为实验材料，克隆了维生素E合成途径中的重要基因JA/无并对其进行了功能验证，这将为以后通过基因工程调控花生的维生素E含量、活性和提高植株的抗逆能力奠定基础。
[0018]结合附图阅读本发明的【具体实施方式】后，本发明的其他特点和优点将变得更加清
/H- ο
【附图说明】
[0019]图1是本发明中花生的遗传转化，a:共培养3 d的子叶外植体；b:培养2 w的子叶外植体；c:添加100 mg /L卡那霉素培养基上筛选的抗性芽(培养4 w); d: 150 mg/L卡那霉素培养基上筛选的抗性苗(培养6 W)。
[0020]图2是本发明中拟转必/?基因植株的PCR鉴定。M: Marker DL2000; 1:未转基因植株(对照)；2-6:拟转基因植株。
[0021]图3是本发明中1.5% NaCl胁迫处理后幼苗后4??基因在不同时间段的相对表达量。
[0022]图4是本发明中对照花育23号和T2代转基因花生种子在0.7%的NaCl溶液中的发芽情况；a:花育23号种子；b-c: T2代转基因花生种子。
[0023]图5是本发明中用高效液相色谱测定对照花育23号和1~2代转基因植株叶片的生育酚含量。a:花育23号叶片的生育酚含量的测定结果；b: T2代转基因植株叶片的生育酚含量的测定结果。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明技术方案作进一步详细的说明。
[0025]实施例1:花生维生素E合成相关基因AhPK 一、实验材料
1.基因、菌种与花生品种
本发明克隆了花生/?基因(4??)，大肠杆菌DH5a由青岛农业大学遗传研宄室实验室保存，根癌农杆菌菌株EHA105 (购自北京天恩泽基因科技有限公司)，转基因的受体材料为花生品种“花育23号”(由山东农科院花生所育成，青岛农业大学遗传研宄室实验室引进)。
[0026]2.植物培养基花生转化中采用的培养基有:
基本培养基:为MS无机盐+85有机成分(简称MSB5)，添加3%蔗糖、0.8%琼脂，pH=5.8，在121。。、105 Kpa条件下灭菌20min ;
SM 诱导培养基:MSB5+5 mg/L BAP +1.5 mg/L 2，4_D ；
SEM芽伸长培养基:MSB5+5 mg/L BAP。
[0027]cef:头孢霉素。
[0028]二、实验方法
本发明包括以下具体实验步骤:
1、扩增获得基因
花生维生素E合成相关基因AhPK,其序列表如SEQ ID No:1所示。
[0029]克隆所述基因引物名称与序列如下:
Pl:5 ; - ATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA -3 ' (SEQ ID No:4)；
P2:5 ; - TACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 ; (SEQ ID No:5);
Pl和P2引物序列分别与4??基因第1-25碱基、第2857-2881碱基对应。
[0030]克隆获得的所述基因A瞒6个外显子，分别对应的碱基分别为第34-366、1316-1378,1498-1631,2011-2128,2270-2384,2685-2863 位。
[0031]所述的花生维生素E合成相关基因4^/%编码产生的蛋白质，其氨基酸序列表如SEQ ID No:2 所示。
[0032]2、4??基因植物表达载体的构建
(I)扩增必/?基因
花生品种“花育23号”由青岛农业大学遗传研宄室实验室引进，通过RT-PCR扩增了4??基因的编码区(其序列表如SEQ ID No:3所示)。
[0033]P3:5 ' - GGTACCATGTCTCTCACTCACACTCCCGTTA ~3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:6);
P4:5 ' - GGTACCTACAATTTGGTCTTACAATCAAAAA -3 ' {Kpnl) (SEQ ID No:7)；
引物P3和P4是在引物Pl和P2的基础上加了酶切位点，引物P3和P4对应扩增cDNA序列。上述引物序列除去酶切接头(下划线部分)外分别与4??基因cDNA序列的第1-25碱基、第969-993碱基对应。
[0034](2)因与克隆载体pUC18及植物表达载体p