淫羊藿破壁饮片的指纹图谱共有模式构建及其质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药饮片的建立检测方法，尤其是淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共 有模式构建及其质量检测方法。
【背景技术】
[0002] 淫羊藿为小檗科植物淫羊藿Epimediumbrevicornu Maxim、箭叶淫羊藿 Epimediumsagittatum(Sie. et Zucc.)、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或卓月鲜 淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶。本发明中的淫羊藿针对小檗科植物淫羊藿 Epimediumbrevicornu Maxim品种。
[0003] 主要成分为黄酮、木脂素、生物碱和多糖。黄酮类成分主要有：淫羊藿苷，朝藿定 A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷I、II，淫羊藿次苷I、II，大花淫羊藿苷A，鼠李糖基淫羊藿次 苷II，箭藿苷A、B、C和金丝桃苷等。
[0004]中药破壁饮片是利用现代超微粉碎技术将传统饮片进行破细胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45ym的微细颗粒，再制成30~100目的颗粒。相对于传统饮片具有色泽一致， 质量均一，稳定性好的特点为创新型中药饮片。由于中药破壁饮片不具传统中药饮片的形 态特征，破壁后会带来有效成分或指标成分等化学成分的溶出度变化，使传统饮片的鉴别、 质量检测方法不能完全适用。因此，必须针对中药破壁饮片建立专属性强，全面反映中药破 壁饮片质量状况的检测方法。而建立一项新的质量检测方法并非易事，例如检测条件、对 照品的选择和供试品的制备方法等均需要研宄考量并进行验证。虽然现有技术中有涉及中 药指纹图谱的检测方法，但并无针对形态特殊的中药破壁饮片的方法，且存在专属性、稳定 性、重现性和精密度差缺陷，不能全面反应饮片质量的缺陷。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建及其质量检测方 法。
[0006] 淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建方法包括以下步骤：
[0007] (1)供试品溶液的制备：精密称定淫羊藿破壁饮片0. 200g，加入50%稀乙醇20mL， 超声提取3〇111；[11，冷却至室温，12001'/111；[11离心5111；[11，上清液倾入201111量瓶中，加50%稀乙 醇稀释并定容至20ml，摇匀，0.22um微孔滤膜过滤备用；
[0008] (2)对照品配制：精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解配制成浓度分别为 0? 116mg/ml的混合对照品溶液；
[0009] (3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱 柱，以乙腈为流动相A，水溶液为流动相B，梯度洗脱：0min-20min-28min-60min，流动相 A:20% -27% -27% -50%;柱温为35°C ;检测波长为272nm ;流速：0? 8mL/min ;
[0010] (4)测定法：精密吸取供试品溶液20yl，对照品10ul注入色谱仪，测定，记录图 谱，即得；
[0011] (5)按上述供试品溶液及对照品的制备方法及和色谱条件对10批以上的淫羊霍 破壁饮片样品进行HPLC分析，得到相应指纹图谱；以淫羊藿苷峰为参照峰，计算各指纹图 谱中主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；输入指纹图谱分析软件，对各批次样品指 纹图谱进行相似度比较，以平均谱图为共有模式，计算相似度，建立淫羊藿破壁饮片指纹图 谱共有模式标准图谱如图3所示，包括16个特征峰。
[0012] 淫羊藿破壁饮片的质量检测方法包括以下步骤：
[0013] (1)按上述标准图谱构建方法中步骤（1)和步骤（2)分别制备待测样品供试品溶 液和对照品溶液，按步骤（3)的色谱条件，精密吸取待测样品供试品溶液20yl，淫羊藿苷 对照品10ul，注入HPLC色谱仪，测定，记录色谱，即得；
[0014] (2)合格指标的建立及指定图谱、判断方法：供试品色谱中，应呈现16个与图 3-淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式相对应的特征峰。按中药色谱指纹图谱相似度 评价系统计算，供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于〇. 90。以淫羊藿苷峰为 对照峰，其余15个共有指纹峰的相对保留时间分别为0. 248、0. 507、0. 691、0. 772、0. 829、 0? 875、0. 931、0. 966、1. 128、、1. 262、1. 458、1. 652、1. 667、1. 781、1. 832,各峰相对保留时间 RSD彡±5%，为合格品。
[0015] 本发明是首次针对淫羊藿破壁饮片质量控制所构建的HPLC指纹图谱共有模式标 准图谱及质量检测方法。该方法克服了现有技术不能完全适用淫羊藿破壁饮片质量控制的 缺陷。该图谱较全面涵盖了淫羊藿饮片主要活性成分的图谱信息，专属性明显优于现有的 同类指纹图谱方法。经试验验证该方法的稳定性、重现性和精密度均达到法定要求，且操作 简单，检测快速准确；并能有效控制淫羊藿药材、破壁粉体、破壁饮片整体质量。
【附图说明】
[0016] 图1是淫羊藿破壁饮片指纹图谱柱子适用性考察谱图。
[0017] 图2是淫羊藿破壁饮片专属性考察。
[0018] 图3是本发明淫羊藿破壁饮片HPLC指纹图谱共有模式标准图谱。
【具体实施方式】
[0019] 一、淫羊藿破壁饮片HPLC标准指纹图谱的构建。
[0020] 本发明以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、箭藿苷B、淫羊藿次苷I、淫羊藿 次苷II、绿原酸8个主要活性成分为目标，建立能较全面反映淫羊藿破壁饮片成分信息，同 时能测定淫羊藿苷含量的标准指纹图谱。
[0021] 1仪器与试药
[0022] 1. 1 仪器
[0023] 安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪（配有G1315C型号DAD检测器、G4218A的ELSD 蒸发光检测器、G1312B二元泵、G1329B自动进样器、G1322A脱气机、G1316B柱温箱，Agilent Chemstation色谱工作站）、万分之一电子分析天平、十万分之一电子分析天平、高功率数 控超声清洗仪等
[0024] 1. 2 试药
[0025]试剂：甲醇（瑞典进口Oceanpak色谱溶剂），乙腈（安徽时联特种溶剂公司色谱 纯），双蒸水、磷酸、甲醇（分析纯）。淫羊藿苷对照品（110737-201312)。
[0026] 供试品：淫羊藿破壁饮片、淫羊藿破壁粉体、淫羊藿原料药材（均由中山中智药业 集团提供）
[0027] 2实验方法
[0028] 2. 1预试验
[0029] 中智淫羊藿破壁饮片主要采用小檗科淫羊藿属淫羊藿药材经过超微粉碎加工而 制成。本研宄在参考公司内部非公开文献的基础上，专门针对淫羊藿破壁饮片，拟定以下几 个方案进行预实验。
[0030] 2. 1. 1 预实验 1
[0031] 样品制备：精确称取0. 2001g淫羊藿破壁饮片（14040101批次），于50ml具塞锥 形瓶中，加入20ml70%的乙醇溶液，浸润30min，称定重量，超声30min，取出，冷却至室温， 用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，粗滤，〇. 22um微孔滤膜过滤备用。
[0032] 色谱条件 1:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色谱柱，柱温 30°C， 流速lml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-水，预梯度1洗脱： 0min-30min-60min,乙腈变化为：5% -100% -5%，进样量为 10ul。
[0033] 色谱条件 2:agilentzorbaxSBC18 (4. 6mmX250mm，5um)色谱柱，柱温 30°C， 流速lml/min，检测波长268nm、270nm、272nm、280nm，流动相：乙腈-水，预梯度2洗脱： 0min_60min，乙腈变化为：5% -100%，进样量为10ul。