一种基于NP-NiGdAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于NP-NiGdOAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法及应用。具体涉及一种AuNCsOBSA作为发光材料，利用纳米多孔材料NP-NiGdOAu优良的生物兼容性和大的比表面积作为基底材料增加抗体的固载量。用G0/AuNCs@BSA作为二抗标记物，属于电化学发光检测技术领域。
【背景技术】
[0002]胃癌在其发生及发展过程中，胃癌细胞通常会产生酶、同功酶、激素和免疫球蛋白等物质，这些与胃癌相关的物质被称为胃癌标志物。这些标志物不仅存在于细胞内或细胞表面，而且还可分泌入血液或体腔，因此可在体液或黏膜组织中测出胃癌标志物，用于胃癌的早期预警或辅助诊断、分析病程、指导治疗、监测复发或转移、判断预后等。
[0003]目前检测胃癌标志物的分析方法主要有放射免疫分析法、酶联免疫分析法和试剂盒法，但是所用的试剂有效期短，具有放射性污染，检测周期长，灵敏度低，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本发明设计了一种特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有的胃癌标志物检测方法存在的问题，提供一种简单快速可靠的基于NP-NiGdOAu和G0/AuNCs@BSA的电化学发光传感器的制备方法和应用，实现对胃癌标志物的快速、灵敏、特异、高效检测。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种基于NP-NiGdOAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤:
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6μ L、0.5-2 mg mL—1的捕获抗体基底材料NP-NiGd@Au/Ab i溶液与电极表面，4 °C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、质量分数为1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用ρΗ6.4-8.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同浓度的待测物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH6.4-8.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(5 )滴涂6 μ L 二抗标记物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用ρΗ6.4-8.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干。
[0006]2.捕获抗体基底材料NP-NiGdOAuAb1溶液的制备
(I)NP-NiGdiAu 的制备将NiGdAl合金放入过量的1.5?2.5 mol/L的氢氧化钠溶液中，在室温下化学腐蚀32?74 h，离心洗涤至中性，在真空干燥箱里干燥12?48 h，制得纳米多孔NiGd ；
将80?120 mL，质量分数为0.005?0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2?3 mL，质量分数为0.5?1.5%的柠檬酸三钠水溶液，加热回流10?20 min，待溶液颜色变成酒红色，将溶液冷却至室温，得到的金纳米粒子，4°C下避光保存。
[0007]将I?3 mg的NP-NiGd分散到I mL超纯水中，加入0.5?L 5 mL金纳米粒子，得到的混合溶液在室温下振荡12?32 h，离心分离，除去过量的金纳米粒子，并将产物NP-NiGdiAu重新分散到I mL超纯水中，制得基底材料NP-NiGdOAu溶液；
(2)捕获抗体基底材料NP-NiGdOAu/Abi溶液的制备
在基底材料NP-NiGdOAu溶液中，加入10?100 μ L、I mg/mL的待测物抗体Ab1溶液，在4°C下振荡孵化24 h，离心除去过量的待测物抗体Ab1，将产物分散到I mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得捕获抗体基底材料NP-NiGdOAuAb1溶液，储存在4 °0下备用。
[0008]3.二抗标记物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液的制备
(1)氧化石墨烯GO的制备
将0.2?0.4 g石墨和1.5?2.1 g高锰酸钾加入到带有磁子的500 mL三口烧瓶中，加入提前混合好的体积比为9:1的浓硫酸和浓磷酸混合液，30?70°C下反应6?24 h，反应结束后，将样品倾倒在预先冻好的30?50 mL的冰块上，缓慢的搅拌下加入200?400μ L，质量分数为30%的过氧化氢，反应20?40 min，离心分离，并依次用0.2 mol/L的盐酸溶液，乙醇洗涤三次，最后用乙醚离心洗涤一次，得到的固体在35 °C下真空干燥，得到棕黄色的固体粉末；
(2)金纳米簇AuNCsOBSA的制备
将0.3?0.8 mmol氯金酸乙醇溶液和0.5 mmol巯基琥泊酸MSA通过通氮气鼓泡的方法与100 mL甲醇混合均匀，在剧烈搅拌下逐滴加入20?30 mL，0.1?0.3 mol/L的新鲜配置的硼氢化钠溶液，生成的深棕色的沉淀，离心分离并用体积比为1:4的水/乙醇溶液洗涤，在真空下干燥，得到MSAOAuNCs固体；
MSAOAuNCs和BSA以质量比为1:10的比例加入5 mL水中，搅拌3?8 min，用I?3mol/L的氢氧化钠调节溶液pH为12，37 °C下搅拌6?8 h，得到的产物透析24 h，冷冻干燥得到 AuNCsiBSA ；
(3)二抗标记物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液的制备
将I?3 mg的氧化石墨稀GO和2 mg的AuNCsOBSA加入2 mL超纯水中，振荡32?72 h，离心并重新分散到I mL，pH7.4的PBS缓冲溶液中，加入0.05?0.15 mg待测物抗体Ab2，在4 °C下孵化12?32 h，离心并重新分散到I mL，pH 7.4的PBS缓冲溶液中，储存在4 °C备用。
[0009]4.待测物的检测方法
(1)使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为800 V，循环伏安扫描电位范围为-1.8V?-0.6V，扫描速率为0.1 V/s ；
(2)在10mL、pH 6.4?8.4的含26?46 mmol/L过硫酸钾的PBS溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的待测物抗原产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替待测物抗原进行检测。
[0010]5.上述所述待测物，选自下列胃癌抗原之一:CEA、CA199、CA50、CA724、CA195、CA242、CYFRA2H。
[0011]本发明的有益成果
Cl)电化学发光传感器制备方法，以AuNCsOBSA为发光材料，利用AuNCsOBSA良好的光学性质，构建的传感器具有更高的灵敏度；
(2)以NP-NiGdOAu作为捕获抗体基底，G0/AuNCs@BSA作为二抗标记物，NP-NiGdOAu和GO/AuNCsiBSA生物兼容性好，比表面积大等优点有效地增加了抗体的固载量。
[0012](3)本发明制备的电化学发光传感器用于胃癌标志物的检测，操作简单，反应快速，信号响应范围宽，可以实现简单、快速、灵敏、特异性检测。
[0013]实施例1一种基于NP-NiGdOAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6μ L、0.5 mg mL—1的捕获抗体基底材料NP-NiGd@Au/Ab i溶液与电极表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4y L、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 6.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同浓度的待测物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH 6.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(5)滴涂6μ L 二抗标记物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用pH 6.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干。
[0014]实施例2—种基于NP-NiGdOAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方法
(1)将直径4mm的玻碳电极依次用1.0 μπι,0.3 μπι,0.05 μπι氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；
(2)滴涂6μ L、I mg mL—1的捕获抗体基底材料NP-NiGd@Au/Ab:溶液与电极表面，4°C
保存至干燥；
(3)滴加4y L、质量分数为2%的牛血清白蛋白溶液，以封闭电极表面的非特异性活性位点，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(4)滴加6μ L不同浓度的待测物抗原，4 °C下孵化30 min,用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干；
(5)滴涂6μ L 二抗标记物G0/AuNCs@BSA/Ab2溶液，用pH 7.4的PBS溶液冲洗电极表面，4 °C晾干。
[0015]实施例3—种基于NP-NiGdOAu的胃癌标志物金纳米簇电致化学发光传感器的制备方