一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用，特别涉及木霉菌分生孢子 合成及其合成调控相关基因，尤其涉及调控木霉分生孢子合成的基因在调控木霉菌分生孢 子产量方面的应用。
【背景技术】
[0002] 木霉作为一种重要的生防菌，广泛分布于几乎所有的温带及热带地区。木霉 是一种非常重要的生防菌，具有促进植物生长、抑制病原菌生长、产生抗生素、次级代谢 产物、诱导植物抗性等多种功能。目前研究较多的主要有5种具有生防潜力：哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)、绿色木霉（T.viride)、康宁木霉（T.koningii)、钩状木霉 (T. hamatum)和长枝木霉（T. longibratum)。尤其哈茨木霉菌得到研究者的越来越多的关 注，Bigirimana发现哈茨木霉菌株T39接种蚕豆根部后，导致蚕豆对灰霉病菌的抗性明显 提高。木霉菌分泌多种酶类，抗性物质，不仅能应用于工业生产（酶类），而且能进行生物防 治农业土传病害应用于农业生产。对于能增加分生孢子的一种疏水蛋白，也就能通过基因 工程的手段增加木霉菌的生物量，即具有重要的应用前景。
[0003] 疏水蛋白最早是研究细菌与寄主吸附机理时发现并提出的，泛指覆盖在微生物细 胞表面的一些疏水物质（hydrophobic substances)。学者研究裂裙菌（Schizophyllum commune)气生菌丝缺陷型thn时，发现其与sc3基因表达受到阻止相关，同时也找到了与 sc3基因同源的其它子实体特异性基因。这类基因编码的蛋白组成的疏水性氨基酸含量较 高，同时与细胞壁的疏水性密切有关，因而被称之为疏水蛋白。疏水蛋白的分子量一般比较 小，约100个氨基酸，大小在10kDa左右，全部氨基酸中疏水的占一半样子，在保守位置上含 8个半胱氨酸残基形成4对二硫键，氨基酸亲水-疏水性特征图谱决定了其具独特而相似的 水缘性图谱特征。疏水蛋白包括两种类型，I型疏水蛋白能形成膜，同时它们仅能在有机溶 剂和2 % SDS中溶解，II型疏水蛋白较容易溶解在60 %甲醇或者2 % SDS中。
[0004] 研究孢子量调控是非常有意义的一项工作。孢子对真菌具有重要的作用，不仅对 增加生物量占据生态位具有作用，而且对繁衍生殖孢子就要特殊的意义。疏水蛋白与产孢 率的关系虽已报导，如禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum)中II类疏水蛋白Hyd5突变株 Fg A hyd5的产孢子大小和孢子数量都变小了，但属致病菌相关研究；致病菌与生防菌属于 不同的生物类群，生物学特性迥异，研究方案存在显著差异，致病菌疏水蛋白的研究在现实 中不能给予生防菌研究以技术启示，而作为生防菌中的一种的木霉菌，其疏水蛋白与孢子 产量的关系如何还属本领域空白，需要本领域技术人员进行针对性的探究。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的在于寻找与木霉分生孢子量相关的功能基 因，提供一种木霉菌疏水蛋白及其编码基因、应用，进而提供一种增加孢子量的方法，为提 高孢子含量木霉工程菌提供技术方法；所述基因命名为Thhyd2,该基因编码的蛋白具有典 型的8个Cys基序并形成4对二硫键，且受逆境诱导表达。通过构建Thhyd2基因的过表达 载体并转化到木霉菌中，成功过表达了木霉菌hyd2基因，所得的转基因木霉菌转化子分生 孢子数增加，气生菌丝也有所增加。体外通过原核表达的方式对改疏水蛋白进行了表达，在 培养基中添加表达的疏水蛋白，能够略微增加孢子量和气生菌丝。本发明将为获得高产孢 率拮抗生防菌提供了重要的科学依据和技术支撑。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种木霉菌疏水蛋白（hydrophobin)，包括如下（a)或（b) 所示的氨基酸序列：
[0008] (a) SEQ ID No : 1所示氨基酸序列；
[0009] (b)SEQ ID No :1所示氨基酸序列经过1~10个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（a)所述蛋白质相同的功能。
[0010] SEQ ID No :1所示由99个氨基酸残基组成，其中第80位至第99位氨基酸残基是 hydrophobin2 结构域；
[0011] 所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非所述结构域中的氨基酸残 基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加，以及对相 关功能的检测可以通过本领域的常规技术来实现。
[0012] 第二方面，本发明提供一种编码所述木霉菌疏水蛋白（hydrophobin)的基因的序 列。
[0013] 优选地，所述基因的cDNA序列如SEQ ID No :2所示。
[0014] 本发明的木霉菌hydrophobin蛋白基因Thhyd2可以是其cDNA序列，也可以是基 因组DNA序列，或者是与这些序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。 例如序列表中SEQID N0 :2所示的DNA序列。
[0015] 第三方面，本发明提供一种所述基因在木霉菌工程菌株构建中的应用。
[0016] 优选地，所述应用具体包括用于提高木霉工程菌株的分生孢子产量。
[0017] 第四方面，本发明提供一种用所述基因提高木霉菌菌株分生孢子产量的方法，所 述方法为：
[0018] 通过重叠PCR的方法，将TrpC启动子序列、TrpC终止子序列和所述基因融合成过 表达框；
[0019] 将通过农杆菌介导的方法，将所述过表达框转化到木霉菌株中，即可获得分生孢 子产量提高的木霉菌转化子、提高分生孢子产量。
[0020] 优选地，所述过表达框的构建具体如下：
[0021] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :12为引物扩增TrpC启动子序列，得片段1 ;
[0022] 以SEQ ID No : 13、SEQ ID No : 14为引物扩增所述基因序列，得片段2 ;
[0023] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :14为引物，以所述片段1、片段2为模板，融合扩增 得所述片段1、片段2的融合片段1 ;
[0024] 以SEQ ID No : 15、SEQ ID No : 16为引物，扩增TrpC终止子序列，得片段3 ;
[0025] 以SEQ ID No :11、SEQ ID No :16为引物，融合扩增得所述融合片段1和片段3得 所述基因的表达框。
[0026] 第五个方面，本发明提供一种通过所述方法构建的木霉菌转化子。
[0027] 优选地，所述木霉菌包括茨木霉菌为T. harzianum T28。
[0028] 本发明的研究发现，木霉菌的Thhyds是受逆境的诱导而表达。通过融合PCR技术 在木霉菌中过表达Thhyd2基因，获得转基因木霉转化子，检测发现这些转基因转化子中分 生孢子的含量相对野生型要高很多。由此推测，利用转基因技术，过表达某些Thhyds，可为 获得高分生孢子含量木霉工程菌种提供重要的科学依据。鉴于该类基因的应用价值及其利 用潜力的应用前景，有必要通过专利加以保护。
[0029] 通过木霉菌转录组测序结果进行de novo拼接，利用所获得的木霉转录组数据以 及NCBI公布的木霉基因组序列片段和EST片段进行曲霉同源hydrophobin的Blast分析， 本发明的相关研究获得了一些木霉菌hydrophobin蛋白（Thhyds)成员。其中，设计引物 克隆了 Thhyd2的0RF全长序列（SEQ ID N0:2)，其编码的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No :1所示。序列分析结果表明，该蛋白含有保守的hydrophobin2结构域。其次，利用通过 RT-PCR及Real-timePCR发现该基因是-C (缺碳源）和H202诱导而表达的（图1)。
[0030] 基于上述研究，本发明通过过表达技术构建了 Thhyd2基因的Overexpression转 基因载体，成功获得了过表达在木霉菌细胞中表达的转基因转化子，所获得的转基因木霉 转化子拥有分生孢子含量相对对照明显升高的表型。可见，利用转基因技术，过表达Thhyd2 基因能够获得高分生孢子的转基因木霉菌，这使得高分生孢子的工程菌成为可能，为提高 木霉发酵产物的产量提供了一种有效的技术手段。在本发明的一个具体实例中，首先，为构 建Thhyd2的Overexpression表达载体，选择此基因cDNA读码框片段（序列表SEQ ID N0 : 2)为Overexpression的表达序列，曲霉菌TrpC启动子序列（SEQ ID NO :3)和TrpC终止 序列（SEQ ID NO :4)分别作为目的表达基因的引导序列和终止序列，设计引物分别获得上 述三段序列，然后通过融合PCR技术使其形成一个完整表达框。如图2所示，该载体中的除 了 TrpC启动子引导表达Thhyd2表达盒之外，还有由TrpC启动子引导表达Hygromycin表 达框的抗性筛选标记。之后，将此质粒转入农杆菌EHA105,并经由农杆菌将此质粒转入木霉 菌T28中。进而，通过Real-timePCR方法对Thhyd2表达量进行了检测。结果显示，所获得 的转基因转化子中Thhyd2的表达量明显增高（图3)。
[0031] 针对Thhyd2_0verexpression木霉菌转基因转化子，利用血球板计数板测定了在 28°C在SM和SM(缺碳源）培养基中培养6天，测定分生孢子的量。相比对照野生型孢子量， 过表达转化子分生孢子量有提高明显（图4)。通过原核表达Hyd2蛋白，添加到5 yM Hyd2 蛋白到SM培养基中，野生型木霉菌的分生孢子书有所增加（图5)。因此，本发明为获得提 高分生孢子含量木霉工程菌提供重要的科学依据和技术支撑。
【附图说明】
[0032] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0033] 图l、Real-time PCR检测低糖㈧和H202逆境下⑶Thhyd2的表达变化，其中：低 糖、5mM H202条件下Thhyd2诱导表达明显，以Actin为内参；
[0034] 图2、Thhyd2_0verexpression木霉表达载体构建示意图，该载体中，Thhyd2过表 达引导和终止序列分别为TrpC启动子和终