噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及利用噬菌体展示技术筛选的具有抗凝血活性的多肽，属于抗凝血药物 研发与应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 凝血是机体重要的生理防御过程，但病理性血栓严重危害着人类健康。血栓栓塞 症已经成为临床上常见的致残及致死的重要原因之一，它主要发生在心脑血管疾病患者、 手术后病人以及孕产妇当中。此外，现代临床检验中，许多检验项目的血液标本需要抗凝来 检测，而在体外血液很容易凝固。这就使得研究高效、稳定、副作用小的抗凝血药物或制剂 成为一个有巨大临床应用价值和前景的热点。
[0003] 能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，称为抗凝剂或抗凝物质。目前应用在临床 检验的抗凝剂主要有天然抗凝剂（如肝素）、Ca2+鳌合剂（柠檬酸钠、氟化钾、EDTA、草酸盐 等），应用于临床治疗的主要有肝素、水蛭素、丹参、阿司匹林以及华法林等。其中肝素是一 种酸性不对称结构的糖胺聚糖，抗凝作用在体内外均较强，在临床上应用比较广泛，但用量 过大时会引起出血、血小板减少、骨质疏松、耐药性和过敏等副反应。水蛭素及其衍生物比 伐卢定是肝素安全有效的替代药，可用于肝素诱导的血小板减少症，且不易发生导管血栓。 水蛭素衍生物基因工程双功能水蛭素（RGD-hirudin)已于2005年获国家食品药品监督管 理局批准进入临床研究，临床适应症为血管吻合术后的抗凝、防栓治疗，并可用于治疗心绞 痛、深静脉血栓等疾病。比伐卢定（Bivalirudin，Hirulog)地西卢定（desirudin)及来匹卢 定（1印irudin)是水蛭素的衍生肽。其中比伐卢定的效果较好，能通过用序列（D)-F-P-R-P 结合凝血酶抑制凝血。小分子类肽代替（D)-F-P-R-P合成价廉及给药方便的抗凝血药，目 前已取得很大进展，它们均为功能单一的凝血酶催化中心抑制剂或因子X a等抑制剂。丹 参和阿司匹林通过抑制血小板聚集达到抗凝血作用。华法林是目前应用最广泛的口服抗 凝药之一，为双香豆素衍生物，它通过与维生素K竞争羧化酶，阻碍凝血因子激活和阻滞抗 凝，从而达到抗凝作用。临床用于预防或治疗血管内血栓形成及手术或受伤后引起的血栓 性静脉炎等。
[0004] 除此以外，目前国内外临床使用的主要抗凝血药物还存在能透过胎盘致畸、损害 肝肾等副作用。而多肽药物由于其拥有小分子量，对天然蛋白酶酶解的稳定性相对更好，更 易被人体吸收，而且其毒性小、副作用低、无蓄积性、分子认知性良好、构效关系明显、药效 学显著，已成为国际抗凝新药研究的热点，已进入临床应用及临床研究的多肽主要有阿加 曲班（argatroban)、希美加群（ximelagatran)、达比加群（dabigatran)等，还有一系列类 肽化合物被合成。
[0005] 噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使 外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体 表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内，这样使得大量随机多肽与其DNA编码 序列之间建立了直接联系。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活 性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未 结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌 体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮~5轮的"吸附-洗脱-扩增" 后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。
[0006] 目前抗凝血多肽的筛选方法主要包括从生化分离技术、基于序列同源性的生物信 息学方法、在现有天然多肽上进行修饰合成等等，往往具有工作量大、效率低等缺点。随着 噬菌体展示技术的发展，我们以特定的分子为靶标，以特定的分子洗脱特异性结合的噬菌 体，使所产生的多肽功能便有了可预测性和较强的目的性。由于肝素能够和肝素结合表皮 生长因子HB-EGF高度特异性结合且具备确定的高度抗凝的作用，因此，HB-EGF被选择作为 靶标，肝素钠竞争性洗脱此类噬菌体，筛选得到类似于肝素抗凝血活性的多肽。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种噬菌体展示技术筛选的 具有抗凝血活性的多肽。
[0008] 本发明首先成功将靶标HB-EGF的目的基因导入了原核表达载体pET-30a，经IPTG 诱导后，带有载体上标签的重组蛋白（His) 6-HB-EGF大量表达。
[0009] 经两步亲和层析纯化后，我们得到了较纯的重组蛋白（His)6-HB-EGF,然后为了排 除噬菌体会结合标签蛋白从而造成非特异性序列产生的可能性，我们利用重组蛋白上的肠 激酶酶切位点将其标签酶解去掉，之后利用镍柱亲和层析去掉酶切后蛋白样品中的标签蛋 白，最终得到了 HB-EGF。
[0010] HB-EGF经包被固定以后，使随机十二肽噬菌体文库中的噬菌体与之结合，以具有 抗凝血活性的肝素钠为有效成分竞争性洗脱特异性结合靶分子的噬菌体，经过3轮淘选， 富集得到具有高亲和力的噬菌体。将淘选到的单克隆噬菌体扩增提取之后，对其进行测 序，并合成了出现频率较高（73%，17%)的两个多肽，多肽1(SEQ. ID. NO. 1)和多肽2 (SEQ. ID. NO. 2) 〇
[0011] 经APTT、试管法、剪尾法对多肽进行体内外抗凝血活性验证，结果表明其中多肽2 具有显著的抗凝血活性（P〈〇. 05或P〈0. 01)且呈剂量依赖性，而多肽1并没有明显的抗凝 活性（P>0. 05)。将体内注入多肽的小鼠留作观察一周，发现小鼠各项生理指标和行为基本 正常，且没有发生死亡。
[0012] 本发明所提供的多肽序列如表1.所示：
[0013] 表1?多肽的序列.
[0014]
[0015] 本发明的有益效果：
[0016] 本发明利用噬菌体展示技术筛选得到的多肽，在体内和体外实验均具有显著的抗 凝血活性，并且，未观察到小鼠的急性或慢性毒性作用。本发明中原料靶标HB-EGF和其配 体肝素钠来源广、成本低；而且在淘选多肽的后期，可以通过提取噬菌体很容易得到其所对 应随机多肽的信息；多肽序列较短，在体内容易运输，且易于实现规模化生产，所以整个生 产过程耗时短、成本低、操作易行，同时又大大提高了药物筛选的成功率，使得本发明具有 广阔的临床应用价值和前景。
【附图说明】
[0017] 图1.重组蛋白（His)6-HB-EGF的氨基酸序列；阴影部分为（His) 6标签，加粗斜体 部分为肠激酶酶切位点，下划线部分为目的蛋白HB-EGF。
[0018] 图2.蛋白表达载体pET-3(W(His)6/HB-EGF的构建验证结果；其中A. 1%琼脂糖 凝胶电泳验证HB-EGF PCR扩增产物；B.重组质粒pET-30aAHis)6/HB-EGF双酶切验证结 果。
[0019] 图3.蛋白表达载体pET-30aAHis)6/HB_EGF的测序结果，其中GeneBankSeq表 示注册的HB-EGF序列，InsertSeq表示实际插入载体的目的基因序列测序结果。
[0020] 图 4. SDS-PAGE和 Western Blotting验证重组蛋白（His)6-HB-EGF 的表达、纯化及 酶切结果；其中A. 15% SDS-PAGE验证蛋白诱导表达结果，其中M是蛋白标记，1是pET-30a 空载体表达的蛋白，2是未经IPTG诱导的pET-3(W(His) 6/HB-EGF表达的蛋白，3-4是0. 8mM IPTG诱导的pET-30aAHis)6/HB-EGF表达的蛋白；B. Western Blotting验证（His)6-HB-EGF 表达和肠激酶酶切结果，所用抗体为HB-EGF单克隆抗体，其中1是蛋白（His) 6-HB-EGF, 2是酶切之后的蛋白样品HB-EGF ;C. 15% SDS-PAGE分析蛋白纯化结果，1-4是连续收集的 蛋白洗脱样品；D. Western Blotting检测肠激酶酶切（His)6-HB-EGF蛋白结果，所用抗体 为（His)6单克隆抗体，其中1表示全长蛋白（His) 6-HB-EGF，2-3表示酶切之后的蛋白样品 (His)6〇
[0021] 图5.噬菌体展示流程图，其中A.以HB-EGF为靶分子，使噬菌体随机十二肽库与 预先固定好的靶分子结合；B.洗掉未结合的噬菌体；C.用HB-EGF配体0. 5mM的肝素钠溶液 洗脱特异性结合靶分子的噬菌体；D.将洗脱下来的噬菌体扩增后进行下一轮的筛选；E.按 照A、B、C、D进行3轮淘选，最终富集到与靶分子特异性结合的噬菌体。
[0022] 图6.噬菌体淘选序列分布结果图；经3轮淘选之后，对得到的噬菌体随机多肽序 列进行测序，共得到5种序列，多肽1即序列1，其氨基酸序列为TNCVQTRSLCPP ;多肽2即序 列2,其氨基酸序列为AGAEVEALFNNK。
[0023] 图7.多肽体内外的抗凝血效果检测图，其中A.试管法检测多肽1和多肽2体内 抗凝血作用；B.剪尾法检测多肽2体内抗凝血作用；C. APTT检测多肽2体外抗凝血作用。* 表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01，林*表示P〈0. 001，NS表示无统计学意义。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1. pET-3(W(His)6/HB-EGF蛋白表达载体的构建
[0025] 从 GeneBank 里提取编码 HB-EGF 的片段（aa63 - 149, GenBank 注册号 NM_001945)， 设计 PCR 引物：Forward primer 5' -CGGGATCCGACTTGCAAGAGGCAGAT-3'(SEQ. ID. NO. 3)和 Reverse primer 5' -CCAAGCTTTCATGGGAGGCTCAGCCC-3' (SEQ. ID. NO. 4)，下划线部分别为 酶切位点 BamHI 和 Hind III。PCR 产物和载体 pET-30a (Novagen，#69909-3)经 BamHI (NEW ENGLAND BioLabs，#R0136S)和 Hind III (NEW ENGLAND BioLabs，#R0104S)37°C酶切 3h 之 后，用T4DNA连接酶（NEW ENGLAND BioLabs，#M0202S)在16°C连接12h。将连接产物转化 进入DH5 a感受态细胞（全式金，⑶201)，然后将转化产物涂布在卡那霉素抗性（50 y g/ml) LB平板上培养直至单菌落长出，挑取单菌落，提取质粒进行酶切验证，将重组质粒送华大基 因测序，得到质粒 pET-3(W(His)6/HB-EGF。
[0026] 为大量获得目的蛋白HB-EGF并利于后续的纯化，本发明将HB-EGF基因插入表达 载体pET-30a中，蛋白大量表达后经镍柱亲和层析和肝素亲和层析纯化，最后利用肠激酶 将（把8) 6标签切掉，如图1所示，为重组蛋白（His) 6-HB-EGF的氨基酸序列。图2A显示PCR 反应后得到了目的基因；目的基因被连入载体pET-30a后进行双酶切验证，图2B中显示出 现两个条带，分别是pET-30a载体部分和目的基因HB-EGF部分；最后经过测序验证，图3显 示实际插入载体的目的基因序列与GeneBank中注册的序列比对结果完全相同。
[0027] 实施例2. (His)6-HB-EGF的诱导表达、纯化、酶切及验证
[0028] (His)6-HB-EGF的诱导表达：将重组质粒pET-3(W(His)6/HB-EGF转化宿主菌 BL21 (DE3)(全式金，⑶601)，利用卡那霉素抗性LB平板筛选重组子，挑取单菌落于含卡 那霉素的LB液体培养基中培养至0D6。。= 0. 5~0. 8。将培养物以体积比1:50的比例 接种于LB液体培养基，37°C剧烈震荡培养至0D6。。= 0. 5~0. 8,