，待内皮细胞贴壁生长在中间的多孔膜上，形成类血管内皮屏障。关闭微脉管系统的进口和出口，打开肝脏器官多细胞共培养系统的出口和进口，将悬滴法制备的肝脏细胞聚集体培养液缓慢注入肝脏多细胞共培养系统空腔中，因缝隙宽度比较小，培养液和单个细胞很容易通过，而细胞聚集体的直径比较大，细胞聚集体会不断地富集在月牙槽结构内部，形成更大的细胞聚集体，并根据月牙槽结构的形状进行三维的培养和生长，用新鲜培养液清洗掉未被捕获和富集在月牙槽内部的细胞或细胞聚集体。继续将多种肝脏星形细胞胶质细胞，库普弗细胞，以及成纤维细胞等共培养细胞的培养液缓慢流经微通道进入肝脏多细胞培养系统的空腔内，静置培养2~4小时，贴壁生长。待细胞贴壁牢固后，进行连续的培养液供给。
[0036]实施例3药物活性及安全性检测
待细胞稳定生长和增殖后，进行药物的肝脏毒性和药物活性评价。药物按不同浓度溶解在细胞培养液中，经由微脉管系统通道入口缓慢流入微脉管系统的弯曲脉管内部，药物穿过类血管内皮屏障系统的多孔膜细胞层，进入到下层的肝脏器官多细胞共培养系统，并经由肝脏实质细胞的代谢和转化，以此进行肝脏细胞形貌表征和细胞功能活性(如白蛋白分泌，尿素合成，P450酶活性)的评价，从而评价药物的肝脏毒性和药物活性。另外，药物按不同浓度溶解在细胞培养液中，经由肝脏器官多细胞共培养系统的进口缓慢流入其空腔内部，药物直接作用于肝实质细胞聚集体和多细胞种类，并经由肝脏实质细胞的代谢和转化，以此进行肝脏细胞形貌表征和细胞功能活性的评价，从而也进行药物对正常肝脏细胞的安全性或药物对病理肝脏细胞的药物活性的检测。
[0037]上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:包括位于上层的微脉管系统(1)，中间的类血管内皮屏障系统(2)和下层的肝脏器官多细胞共培养系统(3)，微脉管系统(I)和肝脏器官多细胞共培养系统(3)分别设置于各自的片基上；其中，所述微脉管系统(I)包括由若干阻流栅栏(4)交错布置构成的弯曲脉管(5)，所述弯曲脉管(5)两端分别设有微脉管进口( 6 )和微脉管出口( 7 );所述类血管内皮屏障系统(2 )由多孔膜(8 )组成；所述肝脏器官多细胞共培养系统(3)包括细胞聚集体富集区(9)和多种细胞共培养区(10)，并在两端分别设置有培养系统进口( 12)和培养系统出口( 11)，肝脏器官多细胞共培养系统(3)位于培养系统进口( 12)的内部区域设置有两个分流栅栏(13)，其中，细胞聚集体富集区(9)由多个月牙槽状结构(15)组成，每个月牙槽状结构(15)上均设置有若干缝隙(14)，多个月牙槽状结构(15)纵向排列成若干列，且该若干列交错布置，所有月牙槽状结构(15)的开口均朝着培养系统进口( 12 )。2.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:所述片基为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、玻璃、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝酸纤维素、生物膜、娃片的一种或几种。3.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:所述肝脏器官多细胞共培养系统(3)所用的细胞粘附和培养基质为胶原蛋白、纤维蛋白胶、细胞外基质蛋白、BSA蛋白、丝素蛋白、明胶、壳聚糖、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、基质胶、海藻酸钠、异甲基丙烯酰胺、聚乙二醇或聚乙二醇丙烯酸酯的一种或几种。4.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:所述微脉管系统(I)的微脉管入口(6)和微脉管出口(7)通道深度，阻流栅栏(4)高度和弯曲脉管(5)深度均为100 μ m ;阻流栅栏(4)的宽度为20 μ m，形状为半圆形倒角，且与肝脏器官多细胞共培养系统(3)中月牙槽状结构(15)的位置相对应；弯曲脉管(5)是圆滑的通道，通道宽度为600 μ m，弯曲数为20。5.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:所述多孔膜(8)的材料为聚二甲基硅氧烷、TranswelI用的PET或PC膜的一种，厚度为10 μ m，孔径为 0.4，1，3，5，8μηι。6.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，其特征在于:所述肝脏器官多细胞共培养系统(3 )的培养系统入口( 11)和培养系统出口( 12 )通道深度，分流栅栏(13)和月牙槽状结构(15)的高度均为100 μπι ;分流栅栏(13)为圆滑弧形，与进口通道对齐，并等距对称布置；月牙槽状结构(15)的个数为80个，其外圆环半径为350 μ m，内圆环半径为150 μ m，月牙槽状结构(15)上的缝隙(14)为四个，并均匀发散排列，其宽度为20 μ m，深度100 μ m，内圆环开口直线距离为100 μ m，月牙槽状结构(15)相互之间的间隔距离为100 μ mD7.—种权利要求1-6任一所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)用计算机辅助设计软件设计和绘制器官芯片的掩膜板，精确绘制各层芯片的微结构和微通道图形； (2)通过微加工技术，特别是光刻蚀的方法，制备出上下两层的掩膜，制备出含有微结构和微通道的芯片； (3)将上层的微脉管系统芯片，中间的多孔膜和下层的肝脏器官多细胞共培养系统进行对齐，加压，并进行等离子体键合，形成三维立体的微结构和微通道网络； (4)通过微脉管进口和培养系统进口通道依次种植不同细胞种类，并进行贴壁和三维聚集体培养，并进行肝脏实质细胞形貌和功能性评价； (5)通过上层和下层通道依次通入药物进行药物肝脏毒性和药物活性评价。8.根据权利要求7所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法，其特征在于:在微脉管系统(I)和类血管内皮屏障系统(2)形成的密闭区域中种植血管内皮细胞，细胞密度为IxlO6个/mL，贴壁培养2~4小时，形成血管内皮细胞层。9.根据权利要求7所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法，其特征在于:在肝脏器官多细胞共培养系统(3)依次种植多种细胞，肝脏细胞聚集体首先通过培养系统进口( 12)通道进入细胞聚集体富集区(9)的月牙槽状结构(15)，并富集生长为三维聚集体生长；多种细胞共培养区(10)通过培养系统进口(12)通道种植共培养细胞种类，共培养细胞种类包括肝星形细胞，库普弗细胞，角质细胞，以及成纤维细胞，细胞密度为IxlO6个/mL，贴壁培养2~4小时。10.一种权利要求1-6任一所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的使用方法，其特征在于:在进行药物评价时，药物通过微脉管系统(I)进入芯片，然后穿透类血管内皮屏障系统(2)，进入到下层的肝脏器官多细胞共培养系统(3)，从而评价其肝脏的毒性作用以及进行药物的代谢和转化；或者，药物也通过培养系统进口(12)直接进入肝脏器官多细胞共培养系统(3)，与肝实质细胞聚集体和共培养细胞直接进行接触并实现代谢和转化，并验证药物的肝脏毒性和药物活力。
【专利摘要】本发明公开了一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片，包括位于上层的微脉管系统，中间的类血管内皮屏障系统和下层的肝脏器官多细胞共培养系统，微脉管系统和肝脏器官多细胞共培养系统分别设置于各自的片基上；其中，所述微脉管系统包括由若干阻流栅栏交错布置构成的弯曲脉管，所述弯曲脉管两端分别设有微脉管进口和微脉管出口；所述类血管内皮屏障系统由多孔膜组成；所述肝脏器官多细胞共培养系统包括细胞聚集体富集区和多种细胞共培养区，并在两端分别设置有培养系统进口和培养系统出口。本发明可以进行肝脏疾病模型的制备以及药物代谢动力学和药物活性的研究，具有样品用量小，药物低消耗，便携、经济、高效、准确的特点。
【IPC分类】C12Q1/02, C12M3/00, C12M3/04
【公开号】CN105176816
【申请号】
【发明人】顾忠泽, 郑付印, 赵远锦, 付繁繁, 赵泽, 魏红梅
【申请人】东南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月30日