一种培养基及其应用、制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种培养基及其应用、制备方法。
【背景技术】
[0002] 角膜病是一种常见的致盲性眼病，患病率较高，且治疗较困难。目前对角膜性致盲 的复明，较为有效的方法是进行同种异体角膜移植，但是角膜移植手术通常由于严重的免 疫排斥反应而失败，且适合的供体组织十分短缺。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘 干细胞作为角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。角膜缘干细胞同其它干细胞一样具 有分化程度低、细胞周期长、高度增殖潜能、自我更新能力和应激增殖等特征，并且研究发 现体外培养的角膜缘干细胞可能会失去部分抗原性，有利于临床移植。
[0003] 尽管大量研究证实角膜缘干细胞可作为种子细胞分化为角膜上皮细胞，但细胞 来源的有限性使其应用受到限制。也有研究表明，通过建立角膜上皮细胞系（corneal epithelial cell line)能够长期稳定地为不同研究目的提供所需的细胞，如上皮的增殖、 分化、眼科用药的测试、角膜疾病新的治疗方法的开发等等。角膜上皮的研究使人们对角膜 的生理、病理特点和角膜疾病有了更深入的了解；但由于分化后的角膜上皮细胞体外生长 的生命周期很短，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜 的构建。因此如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、能不断分裂生长的角膜上皮 细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。
[0004] 近年来研究表明，间充质干细胞在体外不同条件诱导下可以定向分化为脂肪细 胞、成骨细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等，这类细胞相对来源充足、取材方 便、易于培养，且免疫原性低，可作为组织工程良好的种子细胞来源。自Mitchell等首次自 脐带中成功地分离出脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)并证实其多分化潜能后，对脐带组织 来源间充质干细胞的研究引起了广泛关注，越来越多的研究集中到该领域中。从hUC-MSCs 被发现至今，中外学者已经进行相当多的研究，其具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等特 点吸引了众多的研究者。从脐带中分离提取间充质干细胞的重要意义在于，脐带作为分娩 废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理限制。但是hUC-MSCs在体外能否有效地 分化为角膜上皮细胞，仍是学术界的一大研究热点。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种培养基及其应用、制备方法。该培养基明显提高了 hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几率。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种培养基，包括角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质。
[0008] 在本发明中，研究发现角膜上皮细胞培养上清液和角膜基质中含有多种促 hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的细胞因子和有效成分，从而可大大提高hUC-MSCs 向角膜上皮细胞特异性分化的几率。
[0009] 作为优选，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为I : (10~20)。
[0010] 优选地，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1 :1〇。
[0011] 作为优选，培养基还包括人间充质干细胞完全培养基。
[0012] 作为优选，人间充质干细胞完全培养基的配方为：80~120U/mL青霉素，80~ 120U/mL链霉素，45 %~75 %角朊细胞无血清培养基的培养液，5~25ng/mL表皮生长因子 (EGF)，5~25 μ g/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。
[0013] 在本发明提供的一些实施例中，人间充质干细胞完全培养基的配方为：100U/mL 青霉素，1001]/1^链霉素，45%角朊细胞无血清培养基的培养液，151^/11^表皮生长因子 (EGF)，15 μ g/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。
[0014] 作为优选，人间充质干细胞完全培养基与角膜上皮细胞培养上清液混合制得混合 培养基，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量至少为25%。
[0015] 优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为50 %~ 75%。
[0016] 更优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为75%。
[0017] 本发明还提供了该培养基在诱导人间充质干细胞分化为角膜上皮细胞中的应用。
[0018] 本发明还提供了该培养基的制备方法，包括如下步骤：
[0019] 步骤1 :待角膜上皮细胞达80 %~90 %融合，酶解，获得细胞悬液；
[0020] 步骤2 :取细胞悬液接种，培养，收集角膜上皮细胞培养上清液；
[0021] 步骤3 :取角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液混合，获得培养基。
[0022] 作为优选，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1 : (10~20)。
[0023] 优选地，角膜基质与角膜上皮细胞培养上清液的体积比为1 :10。
[0024] 作为优选，步骤3为将人间充质干细胞完全培养基与角膜上皮细胞培养上清液混 合制得混合培养基，取角膜基质与混合培养基混合，获得培养基。
[0025] 作为优选，人间充质干细胞完全培养基的配方为：80~120U/mL青霉素，80~ 120U/mL链霉素，体积分数为45 %~75 %角朊细胞无血清培养基的培养液，5~25ng/mL表 皮生长因子（EGF)，5~25 μ g/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。
[0026] 在本发明提供的一些实施例中，人间充质干细胞完全培养基的配方为：100U/mL 青霉素，1001]/1^链霉素，体积分数为45%角朊细胞无血清培养基的培养液，151^/11^表皮 生长因子（EGF)，15 μ g/mL胰岛素，余量为人干细胞无血清培养液。
[0027] 作为优选，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量至少为 25%〇
[0028] 优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为50 %~ 75%。
[0029] 更优选地，角膜上皮细胞培养上清液在混合培养基中的体积百分含量为75%。
[0030] 作为优选，步骤2中培养的时间为24~72h。
[0031] 优选地，步骤2中培养的时间为48h。
[0032] 作为优选，步骤2中培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养基，其配方为：80~ 120U/mL青霉素，80~120U/mL链霉素，5%~20%胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。
[0033] 在本发明提供的一些实施例中，步骤2中培养采用的培养基为角膜上皮细胞培养 基，其配方为：100U/mL青霉素，lOOU/mL链霉素，10%胎牛血清，余量为DMEM/F12培养基。
[0034] 本发明提供了 一种培养基及其应用、制备方法。该培养基包括角膜上皮细胞培养 上清液和角膜基质。本发明至少具有如下优势：
[0035] (1)本发明提供的培养基明显提高了 hUC-MSCs向角膜上皮细胞特异性分化的几 率。
[0036] (2)脐带作为分娩废弃物，来源广泛，取材方便，不受任何伦理及法理限制。
[0037] (3) hUC-MSCs分离提取操作简单方便、易于培养，且免疫原性低，可作为眼角膜损 伤修复的良好种子细胞来源。
【附图说明】
[0038] 图1示不同的培养基对hUC-MSCs培养的诱导分化率检测结果。
【具体实施方式】
[0039] 本发明公开了 一种培养基及其应用、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实