一种新型脂肪酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种新型脂肪酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性 酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的 活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有广泛的应用价 值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应 用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。
[0003] 脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的 种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解 油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的 是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消 化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制 着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富 (Pandey 等）。
[0004] 脂肪酶在生物体内具有相当重要的生理功能，外源脂肪需要经过脂肪酶消化分解 后才能透过细胞膜，体内脂肪的储藏和动用也少不了脂肪酶，脂肪酶也参与细胞内脂类代 谢。脂肪酶分解三酰甘油产生的单酰甘油、脂肪酸和甘油，除了作为生物体的能源外，还是 合成磷脂、鞘脂等具有重要生理功能的类脂的前体。
[0005] 作为主要的饲用酶制剂，脂肪酶已被普遍应用于畜禽养殖中。人们通过在饲料中 添加脂肪酶，可以有效补充养殖动物内源消化酶的不足，降低营养性腹泻的发生率，提高饲 料中脂肪的消化率和利用率，促进养殖动物对脂肪溶性维生素和其他微量元素的吸收利 用，进而能大幅度提高饲料报酬，降低饲料成本，增加养殖户的经济效益。因此，对高酶活、 性能优良的脂肪酶的筛选和研究仍是目前饲用酶制剂领域的研究热点之一。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种新型脂肪酶及其在饲料中的应用。本发明利用分子生物 学手段从烟曲霉（Aspergillus fumigatus)中克隆得到一种新型脂肪酶，其在中性和酸性 环境中能保持较高的酶活力，且对胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，这些特性使 得该酶更适合应用于动物饲料中。
[0007] 本发明一方面提供了一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。
[0008] 所述脂肪酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :2。
[0009] 本发明还提供携带有上述脂肪酶基因的质粒。
[0010] 本发明还包括携带有上述质粒的里氏木霉（Trichoderma reesei)。
[0011] 本发明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3. 0-4. 0, pH6. 0-7. 0范围内能保持50%以 上的酶活，具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条件下具有很强的耐受性；最适作用 温度为40-50°C，且能在30-50°C范围内保持85%以上的酶活。本发明提供的脂肪酶AFLip 对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，能有效适应动物的胃、肠道环境，并能 保持较高的酶活水平，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶AFLip 能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉 比，提高养殖动物的生产性能，增加经济效益，应用前景广泛。
【附图说明】
[0012] 图1为脂肪酶AFLip作用pH-相对酶活曲线；
[0013] 图2为脂肪酶AFLip作用温度-相对酶活曲线。
【具体实施方式】
[0014] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如
[0015] MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook，2001)和 CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY (AusubeL, 2003)中所记载的方法。这些一般性 参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于 所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
[0016] 除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明 所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY 0FMICR0BI0L0GY AND M0LECULARBI0L0GY, 3nd Ed. (SingLeton et aL.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(HaLe etaL.，2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
[0017] 除非另作说明，核酸是按5'至3'方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的 方向从左至右书写。
[0018] 如本文所用，术语"脂肪酶"即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解， 生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。其基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。 它的催化活性决定于它的蛋白质结构。
[0019] 如本文所用，术语"重组"当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核 酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此， 例如，重组细胞是表达在天然（非重组）形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基 因。
[0020] 术语"蛋白质"和"多肽"在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的 单字母或三字母代码。
[0021] 如本文所用，术语"基因"指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的 区域，以及各编码片段（外显子）之间的插入序列（内含子）。
[0022] 术语"核酸"包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。
[0023] 术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可以互换使用。
[0024] 术语"载体"指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载 体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。
[0025] 术语"表达载体"表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接 于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录 的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增 强子以及控制转录和翻译的终止的序列。
[0026] 术语"启动子"表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子 可以是诱导型启动子或组成型启动子。
[0027] 与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个 序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。
[0028] 由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸， 本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。
[0029] 术语"宿主菌株"或"宿主细胞"是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表 达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。
[0030] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0031] 实施例1脂肪酶基因的克隆
[0032] 1)提取烟曲霉总基因组DNA
[0033] 将烟曲霉（Aspergillus fumigatus)接种至摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置 于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400 yL抽提缓冲液（IOOmM Tris-HCL，IOOmM EDTA，250mM NaCL，1% SDS);然后加入IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪中剧烈振荡2min左 右；65°(：水浴20111丨11后，加入20(^1^101順，(：，冰浴10111丨11;13000邝111离心10111丨11，取上清 ；然后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ;13000rpm离心10min，弃上清，用70%乙 醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解，于-20°C保存。
[0034] (2)基因克隆
[0035] 以提取的基因组总DNA为模板，进行PCR扩增。所用引物序列为：
[0036] AFLip-F ：AAATCTAGAATGTTCTCTGGACGGTTTGG