一种纤维二糖水解酶突变体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种纤维二糖水解酶突变体及其在木质纤 维素降解中的应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶（Cellulases)是水解纤维素（β-1，4葡聚糖或者β-D-糖苷键）导致 形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖（cellooligosaccharides)和类似物质的酶。纤维素酶在 传统上已被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶（endoglucanases，EC 3. 2. 1. 4)，外切葡聚 糖酶（exoglucanases)或者纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，EC 3.2. 1.91)和 β-葡 萄糖苷酶（β-D-glucoside glucohydrolase，EC 3. 2. 1.21)。内切葡聚糖酶主要作用于纤 维素纤维的非晶体部分，而外切葡聚糖酶纤维二糖水解酶是唯一可以作用于晶体纤维素的 酶组分。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必 需的。
[0003] 纤维二糖水解酶由3个部分组成：具有催化活性的催化结构域，作用为锚定纤维 素的纤维素结合域以及连接这两个结构域的一段短肽。在水解纤维素过程中，纤维二糖水 解酶主要作用于纤维素线性分子非还原端，水解β -1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖 分子，使结晶纤维素成为易溶解的非结晶纤维素。
[0004] 当前经济过分依赖于石油、煤炭等化石燃料，其不可再生性导致资源逐渐枯竭，燃 烧产生的二氧化碳已造成气候环境的日益恶化。寻找可再生的清洁能源成为各国科研人员 关注的焦点。其中生物质能源因具有来源广泛、价格低廉、再生性强等优点，成为最具潜力 的能源物质。生物乙醇是源于可再生物质的重要能源之一。木质纤维素是地球上最丰富的 可再生资源，全球每年通过光合作用产生的植物约10000亿吨，为避免与人争粮，木质纤维 素将成为生物乙醇生产最具潜力的原料。
[0005] 木质纤维素炼制生物乙醇过程通常包括预处理、水解、发酵、蒸馏等单元操作，其 中纤维素水解为可发酵糖是纤维素乙醇炼制过程中至关重要的环节。目前，木质纤维素的 降解主要有化学法和酶法水解。与化学法水解相比，酶法水解工艺条件温和，设备简单，能 耗低，同时具有副产物少、环境友好等特点，受到广泛重视并取得重大进展。
[0006] 由于木质纤维素中的纤维素主要以结晶状态存在，因此纤维二糖水解酶在木质纤 维素水解中的作用相当重要。但目前现有的纤维二糖水解酶活力低，耗酶量大，发酵成本 高，且其在酸性条件下的酶解效率和转化率普遍偏低，严重限制了木质纤维素在生物乙醇 生产中的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种纤维二糖水解酶突变体及其在木质纤维素降解中的应 用。本发明通过对纤维二糖水解酶进行蛋白质工程改造，获得了突变体蛋白。所述突变体 在酸性条件下的酶活力得到显著提高，且耐热性更强，能大大提高木质纤维素的降解效率， 进而促进其在生物乙醇生产中的应用。
[0008] 本发明一方面提供了一种纤维二糖水解酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 的纤维二糖水解酶第33位氨基酸由Gln变为Lys，第91位氨基酸由Ala变为Lys，第105位 氨基酸由Glu变为Ala，第112位氨基酸由Ala变为Thr，第224位氨基酸由Asp变为Asn。
[0009] 上述纤维二糖水解酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO :3,其编码基因的核酸序 列为 SEQ ID NO :4。
[0010] 本发明另一方面提供了一种重组质粒，其携带有编码序列为SEQ ID NO :4的纤维 二糖水解酶突变体的基因。
[0011] 本发明还提供了一种重组菌株，是通过将上述重组质粒转化入里氏木霉 (Trichoderma reesei)中获得的。
[0012] 本发明还提供了上述纤维二糖水解酶突变体在生物乙醇生产中的应用。
[0013] 本发明提供的纤维二糖水解酶突变体比野生型的耐酸性更强，其最适pH为5. 0， 且在pH4. 0-7. 0范围内均能保持65%以上的酶活水平，而野生型的最适pH为5. 5。所述纤 维二糖水解酶突变体可广泛应用于木质纤维素的降解，能显著提高木质纤维素的糖化率。 其中，添加本发明所述纤维二糖水解酶突变体MAF7A的实验组2中木质纤维素的糖化率比 对照组提高了 9. 5%，比添加野生型纤维二糖水解酶AF7A的实验组1提高了 3. 5%，取得了 意料不到的技术效果。
【附图说明】
[0014] 图1为重组菌株发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中，泳道1为里氏木霉 工程菌AF7A发酵上清液，泳道2为里氏木霉工程菌MAF7A发酵上清液，泳道3为对照组宿 主菌里氏木霉SCHD4发酵上清液，泳道1和2中箭头所指70kDa处的蛋白条带分别为重组 表达的纤维二糖水解酶AF7A和突变体MAF7A ;
[0015] 图2为纤维二糖水解酶突变体与野生型pH-相对酶活曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献 提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实 验方案和试剂。
[0017] 下面结合具体的实施方式对本发明进行详细描述。
[0018] 实施例1 :纤维二糖水解酶突变体基因的筛选
[0019] 为了提高野生型纤维二糖水解酶AF7A(氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，编码核苷酸序 列为SEQ ID NO :2,由上海生工生物工程股份有限公司合成）在酸性条件下的酶活力，通过 定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物AF7A-FUAF7A-R1如下：
[0020] AF7A-F1 ：GGCGAATTCATGATGCTGGCCTCCACCTTCTCC (下划线为限制性内切酶 EcoRI 识别位点）；
[0021] AF7A-R1 :ATAGCGGCCGCCTACAGGCACTGAGAGTAATAATC (下划线为限制性内切酶 NotI 识别位点）；
[0022] 以野生型纤维二糖水解酶AF7A基因 SEQ ID N0:2为模板，利用上述引物用 GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoR I、 Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中， 涂布于LB+Amp平板，37°C倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加 入150 μ L含有0.1 mM IPTG的LB+Amp培养基，37°C，220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体 用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有纤维二糖水解酶的大肠杆菌细胞裂解液。
[0023] 各取50 μ L裂解液至两块新的96孔板，分别在pH6. 0和pH4. 0的条件下测定其纤 维二糖水解酶酶活。结果发现，有些突变子在酸性条件的酶活没有变化，有些突变子的酶 活甚至降低了，对在pH4. 0条件下依然保持高酶活的突变子进行DNA测序，最终，申请人获 得了能显著提高纤维二糖水解酶酸性耐受性的突变位点组合Q33K、Α91Κ、Ε105Α、Α112Τ和 D224N。
[0024] 将含Q33K、Α91Κ、Ε105Α、Α112Τ和D224N突变位点的纤维二糖水解酶突变体命名 为MAF7A，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3,编码核苷酸序列为SEQ ID NOM13SEQ ID NO :4由 上海生工生物工程股份有限公司合成，并且在合成序列5'和3'两端分别加上KpnI和XbaI 两个酶切位点。
[0025] 将合成后的基因片段用限制性内切酶KpnI和XbaI (Fermentas)进行酶切；同时， 用限制性内切酶KpnI和XbaI对载体pTG进行酶切；凝胶回收目的基因片段和载体；并用 T4 DNA连接酶将上述两片段连接，转化Trans5a大肠杆菌，用氨苄青霉素进行筛选。为确 保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen)。
[0026] 使用质粒中量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒，将携带纤维二糖水解酶突变体基因序列的重组表达质粒命名为PTG-MAF7A。
[0027] 实施例2 :纤维二糖水解酶突变体重组菌株的构建及验证
[0028] (1)原生质体制备
[0029] 取里氏木霉（Trichoderma reesei) SCHD4菌株孢子悬液，接种于PDA平板上，30°C 培养6天；待其产孢丰富后，切取约IcmX Icm的菌落置于含120mL YEG+U (0. 5%酵母粉、1 % 葡萄糖、0. 1%尿苷）的液体培养基中，30°C，220rpm振荡培养14~16h ;
[0030] 用无菌纱布过滤收集菌丝体，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL 10mg/mL裂解酶液（Sigma L1412)的三角瓶中，30°C，90rpm作用1-2h;用显微镜观察检测 原生质体转化进展；
[0031] 将预冷的20mL I. 2M山梨醇（I. 2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述 三角瓶中，轻轻摇勾，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4°C离心10min ;弃上 清，加入预冷的5mL I. 2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4°C离心10min ;弃上清，加入适量 预冷的I. 2M山梨醇悬浮分装（200 μ L/管，原生质体浓度为IO8个/mL)。
[0032] (2)表达载体转化与菌株验证
[0033] 以下操作均在冰上进行，取10 μ g重组质粒pTG-MAF7A加入到含有200 μ L原生 质体溶液的7