一种海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊和其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于应用微生物与环境工程技术领域，涉及一种白腐菌共固定化方法，具体涉及一种海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊和其制备方法。
【背景技术】
[0002]白腐菌能够在好氧条件下实现对异生质的降解，在废水处理、环境修复等方面有广阔的应用前景。白腐菌对异生质的降解开始于次生代谢阶段，主要依靠其分泌的木质素降解酶系。该胞外酶系主要包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶，它们通过引发一系列的自由基反应实现异生质的间接的降解。
[0003]然而，将白腐菌直接用于废水处理会有一些不可避免的缺点。首先，白腐菌为丝状真菌，抗剪切力差，反应器中剪切力太大会破坏其菌丝结构，影响其产酶；太小会影响水体的传质和溶氧从而影响菌的生长和降解能力。另外，白腐菌生长和产酶受水质环境影响较大，这意味着在实际应用中要人为的对废水成分进行控制，限制了其应用的范围，增加了应用成本。
[0004]单纯的固定化白腐菌可有效提高白腐菌对环境的适应能力，但是白腐菌的产酶仍受自身代谢的限制。单纯的固定化木质素降解酶系可摆脱白腐菌代谢影响，提高废水的处理效率，但是木质素降解酶系中除漆酶外，其它两种酶都以过氧化氢为直接底物来启动反应，且在实际操作中过氧化氢的量很难控制，这限制了锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种可应用于废水处理的，海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊。同时，本发明还提供了其制备方法。
[0006]本发明技术方案为:
一种海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊，其特征在于:所述生物微胶囊包含有壳体以及壳体内部芯材；壳体材料为海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶内部包埋白腐菌胞外酶交联聚集体；壳体内部芯材为氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液，氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液内部分散有白腐菌细胞和白腐菌胞外酶交联聚集体；所述的白腐菌胞外酶交联聚集体的木质素降解酶总酶活浓度大于60U/L。
[0007]所述的白腐菌细胞为白腐菌菌丝或孢子；白腐菌细胞为菌丝时，浓度10_300g/L，湿重；白腐菌细胞为孢子时，浓度500-10000个/mL。
[0008]氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙和羧甲基纤维素钠浓度均大于0.005g/mL0
[0009]所述的生物微胶囊粒度大小为:3-15mm ;壳体厚度为:0.2-2mm0
[0010]上述海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊的制备方法，包括以下步骤:
O白腐菌胞外酶交联聚集体的制备:将白腐菌接种于液体培养基中，恒温培养6-10天，过滤，收集菌丝，备用；过滤后的滤液经透析，浓缩，制得粗酶液；向粗酶液中加入饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液，搅拌15-20min，得反应液；向反应液中滴加浓度为25%的戊二醛，交联，离心，用醋酸缓冲液洗涤，得到白腐菌胞外酶交联聚集体；
2)白腐菌悬液的制备，从下述a或b中选用任一方法制备白腐菌悬液:
a将步骤I)所收集的菌丝，接种于固体培养基中培养5-8天后，刮取培养基中的白腐菌孢子分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液；
b将步骤I)中收集到的菌丝打散，直接分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，制得白腐菌悬液；
3)共固定化微胶囊的制备:取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于海藻酸钠水溶液中，得溶液A ;然后再取步骤I)中制得的胞外酶交联聚集体分散于步骤2)中的白腐菌悬液中，得溶液B ;搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，搅拌成囊，再加无菌水稀释，过滤，得到微胶囊，然后将微胶囊置于氯化钙水溶液中固定，过滤，用无菌水洗涤3-4次，得到海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊。
[0011]所述的，步骤I)中，液体培养基的组成为:2 g/L ΚΗ2Ρ04、0.25 g/L MgS04、0.1 g/LCaCl2、5 mg/L MnS04、5 mg/L VB1、0.2 g/L 酒石酸钱、20 g/L 葡萄糖和 150 mL/L 的微量元素储备液；
所述的微量元素储备液的组成为=NaCl 1.0g/L、MgSO4-7H20 3.0g/L、FeSO4-7H20100mg/L、CoSO4WH2O 100mg/L、CaCl2 100mg/L、ZnSO4*7H20 100mg/L、CuSO4*5H20 10mg/L、KAl (SO4) 2 100mg/L、H3BO3 lOmg/L 和 NaMoO4 10mg/L。
[0012]所述的，步骤I)中，粗酶液、饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液的体积比为1:5-9:
0-1 ;所述的磷酸缓冲液pH为7.4，浓度为0.2-0.5M。
[0013]所述的，步骤I)中25%戊二醛在反应液中的体积浓度为0.2-0.4%。
[0014]所述的，步骤I)中交联为恒温震荡交联，交联温度为30°C，交联时间为1.5_9h，交联的震荡频率为60_100rpm，离心速度为10000r/min，离心时间为20min。
[0015]所述的，步骤I)中醋酸缓冲液pH为4.5，浓度为20mM。
[0016]所述的，步骤I)中粗酶液包含木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶中的一种或多种。
[0017]所述的，步骤2)中，制得的白腐菌悬液中，含有湿重浓度为10_300g/L的菌丝或浓度为500-10000个/mL的孢子。
[0018]所述的，步骤2)中，氯化钙-羧甲基纤维素钠水溶液中，氯化钙和羧甲基纤维素钠的浓度均大于0.0lg/mL。
[0019]所述的，步骤2)中，固体培养基的组成为:200g/L 土豆浸出液，20g/L葡糖糖，3g/L磷酸二氢钾，1.5g/L硫酸镁和20g/L琼脂。
[0020]所述的，步骤3)中，胞外酶交联聚集体的木质素降解酶总酶活浓度大于60U/L ; 所述的，步骤3)中，海藻酸钠水溶液中海藻酸钠的浓度为0.005-0.04g/mL ; 所述的，步骤3 )中，搅拌成囊时间为I_5min，当溶液B滴加到溶液A中时，溶液B中的氯化钙会迅速与溶液A中的海藻酸钠反应成嚢，搅拌的目的是为了防止两个微胶囊粘连，微胶囊壁厚会随时间的变化而变厚，成囊后用无菌水稀释过滤也是为了防止微胶囊的粘连。
[0021]所述的，步骤3)中，氯化I丐水溶液中固定时间为30_60min，固定所用氯化I丐水溶液中CaCl2浓度为0.02-0.03g/mL，氯化钙水溶液的体积为所得共固定微胶囊体积的I倍以上。
[0022]所述的，步骤3)中，滴加操作可用医用注射器、蠕动栗等可用于滴加的设备；搅拌操作可用磁力搅拌器等搅拌设备。
[0023]本发明制备海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊的原理为:生物微胶囊是一种将生物大分子或微生物、动植物细胞包封在一层亲水性的半透膜内所形成的珠状微胶囊，可为固定在内部的微生物或酶提供微环境，促进微生物的生长以及酶的催化作用。
[0024]白腐菌胞外酶交联聚集体包埋于海藻酸钙凝胶中作为壁材，分散于氯化钙-羧甲基纤维素钠溶液中的白腐菌孢子或菌丝以及交联酶聚集体作为芯材形成共固定化微胶囊。在降解过程中，白腐菌交联酶聚集体首先参与异生质降解，与此同时，白腐菌在代谢过程中分泌的H2O2产生酶系可为交联酶聚集体提供H2O2，促进异生质的降解。
[0025]本发明技术方案其有益效果为:
1、本发明直接将白腐菌胞外酶直接制成交联酶聚集体，省去了将木质素降解酶系提纯的步骤，可有效降低生产成本。
[0026]2、本发明中胞外酶交联聚集体在微胶囊的外部首先与异生质接触，可有效减少降解的启动时间，提高降解效率，且可起到对胶囊内部白腐菌的保护作用。同时，胶囊内部的白腐菌所分泌的产过氧化氢酶系可为交联酶聚集体提供直接底物，促进降解。
[0027]3、本发明胶囊内部为空心结构，可为细胞生长提供一个微环境，有利于菌体的生长。
【附图说明】
[0028]图1为本发明海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊的结构示意图；
图2为本发明海藻酸钙-羧甲基纤维素钠共固定化白腐菌及其胞外酶的生物微胶囊的制备工艺流程。
【具体实施方式】
[0029]
下面通过具体实施例进一步说明本发明，应该理解的是，本发明实施例仅用于阐明本发明，而不是对本发明的限制；在本发明构思的前提下，对本发明方案的简单改进及替换都属于本发明要求的保护范围。
[0030]下述实例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实例中所用的材料、试剂如无特殊说明，均可直接购买或由常规方法得到。
[0031]1、液体培养基组分:2 g/L KH2PO4^0.25 g/L MgS04、0.1 g/L CaCl2,5 mg/L MnSO4'5 mg/L VB1、0.2 g/L酒石酸铵、20 g/L葡萄糖和150 mL/L的微量元素储备液。
[0032]2、微量元素储备液的组分:NaCl 1.0g/L, MgS04*7H20 3.0g/L, FeSO4*7H20 10mg/L、CoS04.7H20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、ZnSO4.7H20 100mg/L、CuS04.5H20 10mg/L、KAl (SO4)2100mg/L、H3BO3 lOmg/L 和 NaMoO4 10mg/L。
[0033]3、固体培养基的组成为:200g/L 土豆浸出液，20g/L葡糖糖，3g/L磷酸二氢钾，1.5g/L硫酸镁和20g/L琼脂。
[0034]4、降解体系的构建:含40mg/L染料的液体培养基。
[0035]实施例1
选取Pheuwrocheiete(购自广东微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号为
GIM3.383)为白腐菌菌种。
[0036]I)白腐菌胞外酶交联聚集体的制备:将白腐菌/3AMerocAgeie chrysosporiun^种于液体培养基中，30°C恒温培养10天，过滤收集菌丝，菌丝备用，滤液进行透析，浓缩，制得粗酶液；向粗酶液中加入饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液(0.2M，pH7.4)，粗酶液、饱和硫酸铵溶液和磷酸缓冲液体积比为1:6:1，磁力搅拌器搅拌下聚集15min，得反应液；向反应液中滴加25%戊二醛，使戊二醛最终体积浓度为0.25%，恒温震荡交联3h，交联温度为30°C，交联震荡频率为60rpm，离心速度为10000r/min，离心时间lOmin，用醋酸缓冲液(20mM，pH4.5)洗涤，得白腐菌胞外酶交联聚集体；
2)白腐菌悬液的制备:将步骤I)所收集的菌丝，接种