一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于Taq酶效率表征领域，特别涉及一种热启动Taq酶的热启动效率表征 方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR)是常用的分子检测技术，PCR 技术是将双链DNA作为模板，把单链寡核苷酸当作引物，通过热稳定的DNA聚合酶催化，经 过热变性、退火、延伸三个步骤的重复循环，从而实现了在体外将特定的核苷酸片段进行指 数级扩增的目的。PCR发生循环反应时对不同的循环步骤有不同的温度，要求的温度分别 为变性（90°C左右）、退火（50°C左右）、延伸（70°C左右），多数酶在高温时就会变性失活。 TaqDNA聚合酶（Taq酶）即便在90°C以上的高温中仍然保持活性，使得在循环步骤中不需 要每个环节都加酶，从而使PCR反应的成本降低，Taq酶也成为PCR反应中最常用的DNA聚 合酶[2]。
[0003] Taq DNA聚合酶的最高生物学活性温度在70°C~75°C，然而PCR反应在升温时 (20°C~70°C )，Taq DNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，容易使PCR反应发生引物二聚体 以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。因此如何在初始循环的热变性前将Taq DNA聚 合酶活性抑制成为了现今的研究热点。研究发现可以通过对酶进行化学修饰、物理隔绝法、 抗原抗体法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行结构改造来将Taq DNA聚合 酶在未达到最适反应温度前的酶活抑制，实现热启动的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，该 方法中的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物 的特异性的问题。同时，该表征方法从多个角度进行验证，及对热启动效率进行半定量的评 估，可以保证结果的可靠性。
[0005] 本发明的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，包括：
[0006] (1)在配制完成的PCR体系中，不加入dNTP，将该反应体系在PCR仪上完成热变性 以后，加入dNTP作为对照；在另一加入修饰后热启动Taq酶的扩增体系中直接加入dNTP， 进行同时扩增，反应结束后，用琼脂糖电泳检测PCR产物，比较两种操作中引物二聚体和非 特异性扩增产物产生的情况，对热启动效率进行评估；
[0007] (2)通过不同的热变性时间对活性的影响，对修饰得到的热启动Taq酶的效果进 行半定量的评估；
[0008] (3)经修饰得到的热启动Taq酶，在热变性的过程中释放活性，通过设定相同的热 变性时间，检测不同的PCR体系中，累积相同的可被检测到的产物量所需要的循环数，对修 饰的效果进行半定量的评估；
[0009] (4)通过比较普通Taq酶和热启动Taq酶在多重扩增中产物的差异，对修饰效果进 行定量评估；
[0010] (5)通过设置不同的热变性时间的关系，比较普通Taq酶与热启动Taq酶的扩增能 力恢复情况与热启动时间，对修饰效果进行评估。
[0011] 所述步骤⑴中热变性（预变性）的条件为95°c，15分钟。
[0012] 所述步骤（1)中扩增为热循环92°C 15s, 57. 4°C lmin, 72°C Imin, 35个循环；补平 72 °C 10min〇
[0013] 所述步骤⑴中反应在伯乐公司的PCR仪（MyCycler? thermal cycler Bio-Rad) 上完成，每个体系设置3重复。
[0014] 所述步骤（2)中热变性时间梯度为95°C，0_20min。
[0015] 所述步骤⑷中多重扩增为预变性95 °C 2min和15min对照组；热循环 92Γ 15s, 60.1 cC Imin, 72Γ lmin，35 个循环；补平 72Γ lOmin。
[0016] 由于经过人工的化学修饰或抗体结合，在常温下，其活性位点被封闭，不具有催化 活性。而在PCR反应初期的热变性阶段，由于体系稳定上升到90°C以上，与活性位点氨基酸 结合的化学基团或抗体与氨基酸的侧链基团解离后，活性位点暴露，恢复其DNA聚合酶活 性，因而这样经过修饰的Taq酶被称为热启动Taq酶。其优点是避免了在常温下引物二聚 体及非特异性扩增的产生。
[0017] 对Taq酶的氨基酸序列及高级结构的分析发现，Taq酶中含有较多的带正电荷的 氨基酸，本发明采用柠康酸酐与带有正电荷的氨基酸残基发生反应，暂时封闭Taq酶的活 性结构域，阻止非特异性的扩增反应。本发明采用化学修饰的方法得到了热启动的Taq酶， 但如何表征其热启动活性还没有明确的方法，本发明运用以下方法对化学修饰的热启动 Taq酶进行了半定量的表征，为制备稳定，高效的热启动Taq酶提供了评判依据。
[0018] (1)手工热启动法
[0019] 在配制完成的PCR体系中，不加入dNTP，将该反应体系在PCR仪上完成热变性以后 (如95°C，5分钟），加入dNTP，将该操作作为手工热启动的对照，在另一加入修饰后热启动 Taq酶的扩增体系中直接加入dNTP，进行同时扩增，反应结束后，用琼脂糖电泳检测PCR产 物，比较两种操作中引物二聚体和非特异性扩增产物产生的情况，对热启动效率进行评估。
[0020] (2)热变性时间法
[0021] 由于经化学修饰的Taq酶，在常温下活性位点被化学基团封闭，不表现DNA聚合酶 的活性，在合适的pH条件下，升高温度，可以使化学基团与被其修饰的氨基酸的氨基解离， 恢复其活性。因此经化学修饰的Taq酶必须在高温（95°C)保温一段时间后才能催化DNA 的合成，因此研究通过不同的保温时间对活性的影响，可以对修饰的效果进行半定量的评 估。
[0022] (3)最低循环数法
[0023] 经修饰的Taq酶，在热变性的过程中释放活性，通过设定不同的热变性时间，检测 相同的PCR体系中，累积相同的产物量所需要的循环数，可以推测Taq酶被修饰的程度，对 修饰的效果进行半定量的评估。
[0024] (4)多重 PCR 法
[0025] 热启动Taq酶由于能有效地减少非特异性产物的产生，因而在多重PCR扩增中，能 表现出更多的优势。可以通过比较普通Taq酶和热启动Taq酶在多重扩增中产物的差异， 可以对修饰效果进行定量评估。
[0026] (5)热变性时间+多重PCR法
[0027] Taq DNA聚合酶在扩增目的片段的时候具有一定的偏好性，片段短的产物更有利 于扩增。在酶活力单位低时，这一现象更为明显。而对于活性位点被封闭的热启动Taq酶， 随着热变性时间的增加，DNA聚合酶活性逐渐恢复，PCR体系扩增目的片段的能力也随之增 强。根据这一原理，设计热变性时间与多重PCR法结合对热启动Taq酶进行表征。
[0028] 有益效果
[0029] 本发明的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增， 影响产物的特异性的问题。同时，本发明的多种评估化学修饰的热启动Taq酶的热启动效 率的方法，从多个角度进行验证，及对热启动效率进行半定量的评估，可以保证结果的可靠 性。
【附图说明】
[0030] 图1为实施例1中引物最适退火温度的电泳图，A, B，C图依次为β -actin(肌动 蛋白），GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶），ubiquitin C(泛素酶C)的退火温度梯度PCR电 泳结果；D图为三重PCR的退火温度梯度PCR结果；
[0031] 图2为实施例2中手工热启动法表征Taq热启动活性的电泳图；
[0032] 图3为实施例3中热变性时间法表征Taq热启动活性的电泳图，A中使用普通Taq 酶，B和C分别使用两种修饰程度不一样的Taq酶；
[0033] 图4为实施例4中最低循环数法表征Taq热启动活性的电泳图，A，B，C图依次为 普通Taq酶，修饰程度较低的Taq酶和修饰程度较高的Taq酶的循环数梯度电泳结果；各图 中数字20-35表示热循环阶段的循环数；
[0034] 图5为实施例5中多重PCR发表征Taq热启动活性的电泳图；图中" + "表示进行 相应的操作，表示不进行该项操作，红线标示的是引物二聚体；
[0035] 图6为实施例6中热启动时间+多重PCR法表征热启动Taq酶的电泳图。 A, B, C, D, E, F 是依次经过 2min, 5min, IOmim, 15min, 20min, 25min 95°C热启动后的 PCR 扩增 结果；各图中泳道1-3使用普通Taq酶；4-6使用修饰程度较低的Taq酶；7-9使用修饰程 度较高的Taq酶。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0037] 实施例1
[0038] 确定引物最适退火温度。
[0039] 本发明实施过程中，针对小鼠基因组设计了 3对PCR引物，引物序列见表1。
[0040] 表1.小鼠基因组引物
[0041] CN 105177111 A 说明书 4/8 页
[0042] 为排除引物自身引物因素导致的非特异性扩增，首先对引物的退火温度进行优 化。
[0043] 设置以下反应体系，如表2所示。
[0044] 表2优化退火温度的反应体系
[0047] 反应程序：预变性 95°C 15min ;热循环 92°C 15s, 57±5°C lmin, 72°C lmin, 35cycl es ;补平 72°C IOmin0 反应在 Mastercycler gradient (eppendorf)上进行。
[0048] 结果如图I所示，β -actin的最适退火温度为60. 1°C ;GAPDH的最适退火温度 为57. 4°C ;ubiquitin C的最适退火温度为53. 6°C ;三重PCR时，最适退火温度设定为 β-actin的最适退火温度为60. 1°C。结果如图1所示，引物最适退火温度的电泳图。图 中泳道 1-12 退火温度不同依次为 52°C，52. 2°C，52. 7°C，53. 6°C，54. 7°C，56. 1°C，57. 4°C， 58. 8°C，60. 1°C，62. 0°C，62. 4°C ;泳道13, 14是不加 DNA模板的阴性对照组。A, B，C图依次 为β -actin，GAPDH，ubiquitin C的退火温度梯度PCR电泳结果；D图为三重PCR的退火温 度梯度PCR结果。
[0049] 实施例2
[0050] 手工热启动法。
[0051] PCR体系的制备过程中，由于Taq酶在低温下同样具备一定的DNA聚合酶的活性， 容易使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。而dNTP作为 Taq酶催化DNA延伸的底物，能够限制聚合反应的进行。在