检测多种新生儿遗传代谢病致病基因的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学检测领域，特别涉及一种可用于二代测序平台的新 生儿遗传代谢病基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 遗传性代谢病（inherited metabolic diseases, IMD)又称为先天性代谢缺陷病 (inborn errors of metabolism，IEM)是因为维持机体正常代谢所必需的某种酶、运载蛋 白、膜或受体等的编码基因发生突变，使其编码的产物功能发生改变，而出现相应的实验室 检查异常和临床症状的一类疾病。它涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、 溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。该类疾病大多为单基因遗传病，少数为线粒体基因 遗传病。这类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭 折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重 负担。因此开展IEM的早期筛查，实现早期诊断成为IMD防治的关键，避免和减少残疾儿童 的发生，对提高人口素质，推动国民经济发展有着重要的意义。
[0003] 目前，頂D的诊断方法主要有尿显色分析、枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色 谱-质谱联用技术（GC-MS)、串联质谱联用技术（MS/MS)、单基因分析等。这些诊断方法用 于頂D筛查具有局限性：（1)普遍通量低，一般一次只能检测一种至几十种，不能满足頂D 可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；（2)不同頂D的检测方法 各异，样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要 尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不大适合以此开展大规模的遗传性代谢病的筛 查，亟需要一种能高通量检测MD多种疾病的技术。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种常见新生儿遗传代谢病相关基因的高效检 测方法，本发明的检测方法旨在降低检测成本。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于新生儿遗传代谢疾病基因体外定性 检测的引物的设计方式，包括如下步骤：
[0006] 1)、获得遗传病相关的致病基因信息：
[0007] 通过OM頂数据库获得多种（例如为22种）遗传性疾病相关的致病基因信息，包 括基因位置信息、突变位点信息，然后根据得到的基因信息从NCBI数据库得到相关基因的 外显子及内含子信息；
[0008] 2)、针对相关基因设计引物：
[0009] 对于每个基因的外显子及外显子内含子结合区域设计对应的特异性引物Fl和 R1，设计原则为：每个外显子外延5bp，以保证将外显子内含子结合区域包含在内；引物序 列区保守，即不存在突变或SNP，Tm值均一，Tm值的差异在5°C之内；扩增产物至少有IObp 的重叠区；在每对引物前加上一段自行设计的序列Al和A2以及一段6个碱基的识别序列， 用以二代测序结果的识别；引物Fl和Rl的序列组成图见原理图，图I ;
[0010] 备注说明：Al对应的是Fl，A2对应的是R1。
[0011] 由于很多基因会由可变剪切形成的不同外显子组合构成的不同转录本，剪接成每 个转录本的外显子在数量或大小上也有所不同，本发明中涉及到的基因的外显子是将目前 NCBI中已发现的不同转录本的外显子集合为设计引物的模板，原理见图2。
[0012] 每个扩增片段长度约300bp。
[0013] Al和A2的序列如下：
[0014] Al(5' -3' ） ：TCTTTCCCTACCGACGCTCTTCCGATCT
[0015] A2(5' -3' ） ：GTGACTGGAGTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0016] 识别序列有 12 个（择一使用），分别为 ATCACG，TTAGGC，ACAGTG，TGACCA，GCCAAT， CAGATC，ACTTGA，ATCACG，TAGCTT，GGCTAC，CTTGTA，GATCAG，每段识别序列可随机加到 Fl 和 Rl中，Fl和Rl中识别序列的组合方式可以作为测序结果中样品和基因的识别信号。
[0017] 本发明还同时提供了用于新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的引物：综合征 型耳聋的第一轮PCR引物序列表如下表1 ;G6H)基因的第一轮PCR引物序列表如下表2 ; SLC12A3基因第一轮PCR引物序列表如下表3 ;
[0018] 表 1
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[0030] 本发明还同时提供了一种试剂盒，该试剂盒含有上述表1~表3所述的引物，该试 剂盒能同时检测多种新生儿遗传病。
[0031] 具体而目，该试剂盒可以用于检测苯丙酬尿症、精氣酸血症、精氣基瑰?自酸尿症、 瓜氨酸血症I型、瓜氨酸血症II型、楓糖尿症、酪氨酸血症I型、酪氨酸血症II型、酪氨酸 血症III型、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、半乳糖血症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、异 戊酸血症、丙酸血症、戊二酸血症I型、肉碱转运障碍、肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症、肉碱棕 榈酰转移酶II缺乏症、遗传性非综合征耳聋、Gitelman综合征这22种常见新生儿遗传病 相关的基因。
[0032] 本发明还同时提供了一种新生儿遗传代谢疾病基因体外定性检测的方法。
[0033] 本发明的方案具体如下：
[0034] 1、获得遗传病相关的致病基因信息（同上）；
[0035] 2、针对相关基因设计引物（同上），
[0036] 3、PCR扩增目的片段：
[0037] 以人的基因组DNA为模板，起始量为20ng，进行PCR扩增，得到两端分别带有Al和 A2机识别序列的目的片段，并进行纯化，得到第一次PCR产物Pl。
[0038] 4、以Pl为模板，进行第二轮PCR扩增。
[0039] 针对第一次的PCR产物Pl设计第二轮PCR的引物F2和R2,F2和R2的序列如下：
[0040] F2(5'-3'）：
[0041] ATGATACGGCGACCACCGGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC
[0042] R2(5'-3'）：
[0043] CAGCAGAAGACGGCATACGAGTCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG
[0044] 以Pl为模板，起始量为50ng，进行第二轮PCR扩增，得到产物P2,对P2进行纯化， 即得到了可以直接用Illumina二代测序平台进行测序的文库L。
[0045] 利用本发明的方法只进行两轮PCR扩增便可以快速地获得致病基因相关的外显 子、外显子内含子结合区序列的测序文库，直接可以利用Illumina测序平台进行高通量测 序，对于一个样本多个基因的多个外显子，可以将第一轮PCR产物纯化后进行等量混合之 后，作为一个模板进行第二轮PCR扩增，大大节省了操作时间和费用。
[0046] 该方法的原理图如图1和图2所示。
[0047] 本发明所述的方法可以用于检测苯丙酮尿症、精氨酸血症、精氨基琥珀酸尿症、瓜 氨酸血症I型、瓜氨酸血症II型、楓糖尿症、酪氨酸血症I型、酪氨酸血症II型、酪氨酸血 症III型、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、半乳糖血症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、异戊 酸血症、丙酸血症、戊二酸血症I型、肉碱转运障碍、肉碱棕榈酰转移酶I缺乏症、肉碱棕榈 酰转移酶II缺乏症、遗传性非综合征耳聋、Gitelman综合征等22种常见新生儿遗传病相 关的基因（如表4所示），该试剂盒可以对22种常见新生儿遗传代谢病相关的40个致病基 因的外显子及外显子内含子结合区域的序列进行二代测序和分析、应用该试剂盒能够准确 尚效的检测相关基因的突变?目息，实现对多种新生儿遗传病的尚效检测，并能大大降低检 测成本。
[0048] 该试剂盒包括的常见新生儿遗传代谢病及相关基因见表4 :
[0049] 表4 22种常见新生儿遗传病的基因信息表
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[0052] 综上所述，本发明针对常见且危害性较高的新生儿遗传代谢性疾病，如苯丙酮尿 症、精氨酸血症、楓糖尿症、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、半乳糖血症、葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶缺乏症、异戊酸血症、遗传性非综合征耳聋、Gitelman综合征等22种常见遗传性疾病， 针对常见致病基因设计相应引物，通过多重PCR扩增外显子、外显子内含子结合区域，采用 扩增子测序方法，能够高通量检测遗传性疾病，用以快速、简便、高效地筛查遗传性疾病，实 现疾病的早期诊断和早期治疗，减少遗传病的致死率和致残率，减轻家庭和社会的负担。
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