一种小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量rt-pcr诊断试剂盒及制备、使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小反刍兽疫一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒及制备、使 用方法。
【背景技术】
[0002] 小反会兽疫（Peste des petits ruminants，PPR)是由小反会兽疫病毒引起的一 种急性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE)将其列为A类疫病，我国规定其为一类疫病。 临床上主要以高热、口炎、腹泻和肺炎为主要特征。本病传播快，发病率、死亡率均高，是严 重危害养羊业的重大疾病之一。
[0003] 目前国内外可用于检测小反刍兽疫病毒的方法包括琼脂凝胶免疫扩散（AGIA)、对 流免疫电泳（CIEP)、病毒中和试验（VNT)、酶联免疫吸附法（ELISA)、RT-PCR等，其中AGIA、 VNT等传统方法要么操作复杂费时较长，要么灵敏度或特异性不高，存在各种各样的问题， 不适合应用于PPR疫情的大规模检测。ELISA方法相对于传统的VNT等方法更加方便快捷， 但也存在一定的缺点，例如不能区分PPR与牛瘟的感染。而RT-PCR方法具有快速、准确、灵 敏、特异等优点，尤其是实时荧光定量RT-PCR方法比普通RT-PCR特异性更强，敏感度更高， 同时一步法实时荧光定量RT-PCR更是有效的解决了两步法RT-PCR容易污染的问题。因 此，本发明设计了针对小反刍兽疫病毒全基因的特异性引物，通过优化反应条件，建立一种 快速、特异、高度敏感的PPRV诊断方法，为PPR防控提供了一定的技术支持。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题在于，提供一种比普通RT-PCR更快速、更有效、更特异、 更敏感的小反刍兽疫病原检测诊断试剂盒及制备、使用方法，以提高特异性，缩短检测时 间，提高检出率，为PPR防治提供更好的技术支持，同时克服现在技术存在的诊断成本高且 难度大、耗时长，容易出现假阳性等不足。
[0005] 本发明的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂，其原料配方为： 1000~2000 μ L 反应液，100~200 μ L 酶混合液，100~200 μ L 荧光探针、100~200 μ L 阳性 对照、100~200 μ L阴性对照和2~3mL超纯水。反应液包括一步法RT-PCR缓冲液、Oligo dT Primer、引物混合液、Mg2+及dNTP,五种液体于反应液中体积比为12:1:1:2:18 ;酶混合液 包括TaKaRa Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RTase、RNases抑制剂，三种溶液于酶混 合液中体积比为1:40:8 ;引物混合液为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性引物Pa与Pb，浓 度为lOMmol/ L ;焚光探针为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性Ps，探针5'端标记FAM基 团，3'端标记TAMRA基团，浓度为IOMmol/ L，引物序列见表1 : 表1引物（Pa与Pb、Ps)序列_
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所述一步法RT-PCR缓冲液为2X0ne St印 RT-PCR Buffer，它包括20mmol/L Tris-HCl (PH8.3)、100mmol/L KCL、质量分数为 0.1% 明胶。
[0006] 所述 Oligo dT Primer，其浓度为 50 μ mol/μ L0
[0007] 所述Mg2+为MgCl 2溶液，其浓度为25mmol/L。
[0008] 所述dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为 1Ommol/ L0
[0009] 所述 TaKaRa Ex Taq HS，其浓度为 5. OU/ μ L。
[0010] 所述 PrimeScript RTase，其浓度为 200U/ μ L〇
[0011] 所述RNases抑制剂，其浓度为40U/ μ L。
[0012] 所述阳性对照为小反刍兽疫病毒全基因中部分序列克隆质粒混合物，其浓度为 I. 7Χ 107copies/KL。
[0013] 所述阴性对照为不含小反刍兽疫全基因序列的pMD19-T空载体质粒。
[0014] 所述超纯水为无 RNase双蒸水。
[0015] 本发明有益效果：本发明将改变小反刍兽疫病毒感染羊无一步法实时荧光定量快 速检测试剂盒使用的局面；发明所建立试剂盒适用于检测临床疑似小反刍兽疫病毒感染羊 病例病料，能够对临床疑似病例进行病原快速检测，灵敏度与特异性大大高于传统方法及 普通RT-PCR检测方法，为羊养殖场及时采取预防措施预防控制该病爆发提供技术支持与 理论依据。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有以下技术效果和特点： (1)耗时少：本发明以实时荧光定量技术基础，相比传统检测方法及普通RT-PCR检测 方法，能快速对疑似病例进行病原检测，大大缩短了检测时间。
[0017] (2)特异性好：本发明设计合成针对于小反刍兽疫全基因的特异性引物及探针，保 证了特异性扩增小反刍兽疫部分保守片段并进行定量检测，准确度极高，极大程度的降低 了假阳性的可能。
[0018] (3)灵敏性高：本发明基于实时荧光定量技术，可检测病原核酸量最低至 I. 7X 102copies/KL。
[0019] (4)污染少：本发明基于实时荧光定量技术，将反转录过程与PCR扩增过程于一管 中进行，减少了中间环节污染的可能，提高了检测结果的准确性。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的制备流 程图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明的实施例：本发明的小反刍兽疫病毒一步法实时荧光定量RT-PCR诊断 试剂盒，其原料配方为：1〇〇〇~2000 μ L反应液，100~200 μ L酶混合液，100~200 μ L荧光 探针、100~200 μ L阳性对照、100~200 μ L阴性对照和2~3mL超纯水。反应液包括一步法 RT-PCR缓冲液、Oligo dT Primer、引物混合液、Mg2+及dNTP，五种液体于反应液中体积比为 12:1:1:2:18;酶混合液包括TaKaRa Ex Taq HS和反转录酶PrimeScript RTase、RNases抑 制剂，三种溶液于酶混合液中体积比为1:40:8 ;引物混合液为针对小反刍兽疫病毒全基因 特异性引物Pa与Pb，浓度为lOMmol/ L ;荧光探针为针对小反刍兽疫病毒全基因特异性Ps， 探针5'端标记FAM基团，3'端标记TAMRA基团，浓度为lOMmol/ L，引物序列见表1 : 表1引物（Pa与Pb、Ps)序列
所述一步法RT-PCR缓冲液为2X0ne St印 RT-PCR Buffer，它包括20mmol/L Tris-HCl (PH8.3)、100mmol/L KCL、0.1% 明胶。
[0022] 所述 Oligo dT Primer，其浓度为 50 μ mol/μ L0
[0023] 所述Mg2+为MgCl 2溶液，其浓度为25mmol/L。
[0024] 所述dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为 1Ommol/ L0
[0025] 所述 TaKaRa Ex Taq HS，其浓度为 5. OU/ μ L。
[0026] 所述 PrimeScript RTase，其浓度为 2〇OU/μ L0
[0027] 所述RNa