一种马尾藻寡糖的制备方法及其在降血糖药物中的应用

一种马尾藻寡糖的制备方法及其在降血糖药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种马尾藻寡糖的制备方法及其在降血糖药物中的应用，属于功能性 寡糖酶解法生产工艺。关于一种分步酶解法制备马尾藻寡糖方法及其在降血糖药品、保健 品、食品中的应用中的应用，本发明的特点在于超声波辅助分步酶解马尾藻多糖制备寡糖。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。目前降糖药或功效不足或有显著的 副作用，开发既具有显著降血糖效果又无副作用的保健食品已经成为当前全球研究热点。 海藻多糖及其降解产物一一特异性海藻低聚糖、寡糖为原料的海洋药源和食药同用的保健 食品原料的开发和功能研究近年来受到广泛关注。酶法降解多糖制备寡糖条件温和、无副 反应、环境友好等优点，是理想的制备方法。
[0003] 马尾藻寡糖的单糖组分包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖等，马 尾藻活性寡糖具有多种生物功能，在药物、保健品、食品等方面用途广泛。与多糖相比，寡糖 具有易溶于水、无抗原性，以及在宿主体内具有较弱的积累效应等优点。但在规模化应用上 受到很大的限制，主要原因是对寡糖制备技术的研究尚不够深入。
[0004] 在目前所公开的海藻寡糖相关专利中，CN101891904B公开了海带寡糖在制备防治 植物病害药物方面的应用;CN 102827899B公开了一种龙须菜琼胶寡糖及其制备方法与其 在制备抗氧化、抗紫外线保健品和化妆品中的应用；CN103333876B公开的琼胶寡糖可与唾 液淀粉酶的激活剂-氯离子协同增强唾液淀粉酶的酶活。CN100508985C公开了一种低分子 量褐藻胶寡糖，虽然提到了其在糖尿病防治方面的应用，但该专利所述低分子量褐藻胶寡 糖，是利用酸水解海藻酸钠所得，而本发明中所述马尾藻寡糖为利用分步酶解的绿色制备 方法制得，具有不会发生副反应、条件温和、环境友好等优点。因此，本发明中通过超声辅助 分步酶解所获得的马尾藻寡糖的降血糖活性均未见其它研究报道或专利。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种制备马尾藻寡糖的方法及其在降血糖药物中的应用。制 备工艺路线简单合理，降低了酶的消耗和生产成本，提高了制备产量，是一种绿色高效制备 马尾藻寡糖的有效方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种超声辅助分步酶解法制备马尾藻寡糖的方法，以马尾藻脱脂和除蛋白后的精多糖 为原料，利用超声波处理，依次添加褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶酶解多糖 后，沸水加热以灭酶活，经乙醇沉降法去除未降解充分多糖，离心上清液过分子筛后截留 物，冷冻干燥制备得到马尾藻寡糖。
[0007] 具体方法为： (1)将马尾藻干燥后粉碎，向马尾藻干粉中加入95%乙醇回流提取1-2小时，干粉重量与 乙醇体积比为1:15-20,回流结束后除去乙醇，烘干得到干燥脱脂的马尾藻粉末；马尾藻粉 末中加入蒸馏水，其中马尾藻质量与蒸馏水体积比为l:25-30,85-90°C下使用水提法提取 2-3小时，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合 后进行浓缩，加入3-4倍体积95%乙醇，4-10°C静置沉淀8-12小时后，离心收集沉淀，真空冷 冻干燥后获得马尾藻粗多糖粉末； (2) 向步骤(1)所得马尾藻粗多糖粉末中加入蒸馏水，其中马尾藻粗多糖粉末质量与蒸 馈水体积比为1: 1〇_20,进彳丁揽摔复溶，用Sevag法、二氣二氣乙烧法、二氣乙酸法中一种或 几种除蛋白5-8次； (3) 利用截留分子量8000-14000以上规格透析袋，去除有机小分子、色素;截留液在50-60°C及转速为20-40 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥得到马尾藻 精多糖粉末； (4) 将步骤(3)中所得马尾藻精多糖粉末用蒸馏水溶解，质量浓度为4-10%，调节pH为 6.5-8.0，加入褐藻胶裂解酶后进行辅助超声酶解15-20min，超声波功率为45-80kHz，然后 置于25-32°C，速度为65-90r/min水浴摇床中进一步酶解l-1.5h后取出，沸水加热5-10 min 以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用； (5) 将步骤(4)离心所得上清液调节pH为5.0-7.0，加入甘露聚糖酶后进行辅助超声酶 解10-15min，超声波功率为45-80kHz，然后置于50-60°C，速度为65-90r/min水浴摇床中进 一步酶解30_60min后取出，沸水加热10-15 min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用； (6) 将步骤(5)离心所得上清液调节pH为4.5-6.5，加入木聚糖酶后进行辅助超声酶解 30-60min，超声波功率为45-80 kHz，然后置于50-60°C，速度为65-90r/min水浴摇床中进一 步酶解30-60min后取出，沸水加热10-15 min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用； (7) 将步骤(6)离心所得上清液调节pH为3.0-6.0，加入果胶酶后进行辅助超声酶解10-15min，超声波功率为45-80kHz，然后置于25-50°C，速度为65-90r/min水浴摇床中进一步酶 解1-2h后取出，沸水加热5-10 min以灭酶活，冷却至室温，离心取上清液备用； (8) 向步骤(7)中酶解后离心所得上清液加入体积比1:3-4的95%乙醇沉降除去降解液 中未降解多糖，4_10°C静置沉淀4-6小时后，离心收集上清，即为马尾藻寡糖粗品溶液； (9) 将步骤(8)中马尾藻寡糖粗品溶液通过2000D的分子筛，滤出液再通过200D的分子 筛，将截留物冷冻干燥，制备得到马尾藻寡糖。
[0008] (10)所述褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶酶与步骤(4)中马尾藻精 多糖的质量比分别为 1:60-85、1:25-45、1:40-65和 1:25-35。
[0009] 本发明的优点在于： ((1)本发明采用超声辅助分步酶解法，依次利用褐藻胶裂解酶、甘露聚糖酶、木聚糖 酶、果胶酶酶解马尾藻多糖，能充分酶切马尾藻多糖复杂键合结构，大幅提高酶解效率并降 低酶用量。
[0010] (2)本发明制备的马尾藻活性寡糖对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制活性，其IC50 值为4.82 mg/mL，且呈现剂量依赖性，同时对胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗具有明显 的促进作用。
【附图说明】
[0011]图1为HepG2胰岛素抵抗细胞形态电镜图。
[0012] 图2为马尾藻寡糖与拜糖平对α-葡萄糖苷酶活性抑制比较。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1 (1) 将马尾藻干燥后粉碎，向马尾藻干粉中加入95%乙醇回流提取2小时，干粉重量与乙 醇体积比为1: 20,回流结束后除去乙醇，烘干得到干燥脱脂的马尾藻粉末；马尾藻粉末中 加入蒸馏水，其中马尾藻质量与蒸馏水体积比为1:30, 90°C下使用水提法提取2小时，提取 结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，加入 3倍体积95%乙醇，4°C静置沉淀12小时后，离心收集沉淀，真空冷冻干燥后马尾藻粗多糖粉 碎； (2) 向步骤(1)所得马尾藻粗多糖中加入蒸馏水，其中马尾藻粗多糖粉末质量与蒸馏水 体积比为1: 20,进行搅拌复溶，用Sevag法除蛋白8次； (3) 利用截留分子量14000以上规格透析袋，去除有机小分子、色素;截留液在60°C及转 速为40 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至膏状，并进行真空冷冻干燥得到马尾藻精多糖粉末； (4) 将步骤(3)中所得马尾藻精多糖粉末用蒸馏水溶解，浓度为10%，调节pH为8.0，加入 褐藻胶裂解酶后进行辅助超声酶解20min，超声波功率为80kHz，然后置于32°C，速度为90r/ min水浴摇床中进一步酶解1.5h后取出，沸水加热10 min以灭酶活，冷却至室温，离心取上 清液备用； (5) 将步骤(4)离心所得上清液调节pH为7.0,加入甘露聚糖酶后进行辅助超声酶解 15min，超声波功率为45-80kHz，然后置于60°C，速度为90r/min水浴摇床中进一步酶解 6