一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编码基因与应用
【技术领域】 本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8及其编 码基因与应用。
【背景技术】 开花是植物由营养生长向生殖生长转变的关键过程，植物的开花时间直接控制植物营 养生长期和生育期的长短。植物经过长期的演化已经进化出了精确调节开花时间的复杂网 络，其中，泛素/26S蛋白酶体途径和类泛素化作为广泛存在的蛋白质翻译后修饰形式，在植 物开花时间调控过程中发挥了重要作用。泛素/26S蛋白酶体途径和类泛素化还可调节蛋白 质功能，参与真核生物体内的细胞周期调控、基因表达调控及生长发育各个过程。 泛素/26S蛋白酶体途径主要由泛素、泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、去 泛素化酶和26S蛋白酶体组成。目前，PUB类E3泛素连接酶基因先后在拟南芥、水稻等植物中 克隆出来。拟南芥中的PUB类E3泛素连接酶基因在抗高温、黑暗及干旱胁迫中发挥着重要功 能。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种大豆HJB类E3泛素连接酶GmPUB8。 本发明的另一目的是提供该大豆E3泛素连接酶GmPUBS的编码基因。 本发明的又一目的是提供该大豆E3泛素连接酶的应用。 本发明的目的通过如下技术方案实现： 一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8，具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。 本发明所述的大豆PUB类E3泛素连接酶的编码基因 GmPUBS，其最大开放阅读框序列如 SEQIDN0.1所示，含有1257bp，编码SEQIDN0.2所示的418个氨基酸残基。 含有本发明GmPUB8基因 SEQ ID N0.1的表达载体。 所述的表达载体优选将SEQ ID N0.1所示的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8的编码基 因利用gateway技术插入植物表达载体pMDC83得到的植物过量表达载体pMDC83-GmPUB8。 使用GmPUB8构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动 子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或抗生素标记物(庆 大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。 含有所述大豆HJB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的工程菌。 所述的工程菌优选将所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUBS编码基因转入根癌农杆菌 EHA105 所得。 扩增所述大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的引物，正向引物序列为SEQ ID NO.3,反向引物序列为SEQ ID NO.4。 扩增所述大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUB8编码基因的实时荧光定量RT-PCR引物，正向 引物序列为SEQ ID NO.5,反向引物序列为SEQ ID NO.6。 所述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUBS在不同光周期下调控开花时间方面的应用。所 述的大豆PUB类E3泛素连接酶GmHJBS的编码基因在不同光周期下调控开花时间方面的应 用。 有益效果： 本发明在大豆基因组中克隆得到一种大豆PUB类E3泛素连接酶GmPUBS的编码基因 GmPUB8，GmPUB8基因在大豆组织器官中特异性表达。转基因拟南芥中过量表达GmPUB8基因， 与对照组相比，在长日照下开花比野生型植株晚，开花时间推迟5天以上，开花时莲座叶片 数较对照增加11片以上；在中日照和短日照下培养，过表达GmPUBS拟南芥植株与对照组相 比，开花比野生型植株早，开花时间分别提前9天和13天以上，开花时莲座叶片数较对照分 别减少11片和13片以上。上述结果说明GmPUBS可以在不同光周期下调控植物的开花时间。 本发明的GmPUBS为在不同光周期下调控大豆的开花时间提供基因材料与理论基础。
【附图说明】 图1 GmPUB8蛋白系统进化树 图2 GmPUB8基因在大豆中的表达特性。 其中：1，根;2,茎;3,叶片;4,花;5,开花后5天幼荚;6,开花后10天幼荚；7,开花后15天 幼荚；8,开花后20天幼荚；9,开花后25天幼荚；10,开花后30天幼荚；11，开花后35天幼荚； 12,开花后40天幼荚；13,开花后45天幼荚；14,开花后50天幼荚。 图3含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌液PCR产物电泳图 谱。 其中：1，DNA marker;2，含有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS 菌液PCR产物。 图4 GmPUB8重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。 其中：1，蛋白marker; 2，含有空载体pET24b的大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS诱导12h; 3，含 有重组表达载体pET24b-GmPUB8的大肠杆菌BL21 (DE3) pLy s S诱导12h。 图5 GmPUBS的体外泛素化活性检测。 利用原核细胞体外重组表达并纯化的GmPUB8-6X组氨酸(His)融合蛋白与兔子泛素激 活酶E1、人泛素结合酶E2及泛素(Ub)混合后，30°C孵育1.5小时。样品经过聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)分离，分别采用ant i-Hi s和ant i-Ub的抗体进行蛋白杂交检测。 图6 GmPUB8过量表达植物表达载体的构建。 图7转GmPUB8基因拟南芥和对照组RT-PCR检测。 WT:野生型;#1-9:转基因型。 图8转GmPUB8基因拟南芥和对照在不同光周期条件下的表型观察。 WT:野生型;#9:转基因株系。 图9转GmPUB8基因拟南芥和对照植株在不同光周期条件下的莲座叶片数和开花时间比 较。**表示野生型WT与转基因株系在0.01水平差异显著。
【具体实施方式】 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解 的含义。 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应 理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用 到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例1 GmPUB8基因的克隆与鉴定 实验材料为大豆(Glycine max(L. )Merr.) '科丰1号'，由南京农业大学国家大豆改良 中心种质库提供，材料种植于温室，常规田间管理。 根据拟南芥中已克隆的PUB类E3泛素连接酶AtPUB23 (At2g35930)序列，在Phy tozome中 的大豆基因组数据库中进行BLASTP搜索，利用生物信息学的方法进行分析，设计GmPUBS基 因开放阅读框(0RF)正向引物GmPUB8-0RF-F: 5 '-ATGGACGAGATCGACGTGCC-3 '（ SEQ ID NO · 3) 和反向引物GmPUB8-0RF-R:5'-TCACGAACTCATTGGAAACGAAG-3'（SEQIDN0·4)，以大豆嫩叶 的cDNA为模板进行PCR扩增GmPUB8的0RF，具体方法如下：取大豆'科丰1号'嫩叶片，置于液 氮中研碎，RNA提取依据TIANGEN总RNA提取试剂盒RNA Plant Extraction Kit DP417进行。 cDNA第一链合成依据TaKaRa试剂公司cDNA第一链合成试剂盒TaKaRa PrimeScript? 1st strand cDNA Synthesis Kit D6110A，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，用上 述引物对进行PCR反应扩增。50μ1 PCR反应体系为：2μ1 cDNA第一链(0.05yg)、1.6μ1引物 (SEQ ID Ν0.3和SEQ ID Ν0·4,5μΜ)、5μ1 10XPCR缓冲液、4μ1 Mg 2+、4μ1 dNTP和 1.25U Ex Taq DNA聚合酶，用超纯水补足50μ1。反应在BIO-RAD PTC-200型PCR仪上进行，其程序为95 。(:变性 5111丨11;941€3〇86(3,581€3〇86(3,72 1€21^11，共35个循环；然后72°(：延伸1〇1^11;4°(：保存。 PCR产物用胶回收试剂盒(天根）回收后连接PMD19-T载体(TaKaRa)、转化大肠杆菌DH5a感受 态细胞、蓝白斑筛选、摇菌、测序。序列分析结果表明PCR产物具有序列表中SEQID NO. 1的核 苷酸序列，命名为GmPUB8。从NCBI中收集多个物种的PUB类E3泛素连接酶PUB蛋白序列， ClustalX进行蛋白序列比对分析，发现GmPUB8与其他物种中的同类蛋白序列同源度较低， 与拟南芥中的AtPUB22和AtPUB23的同源性分别达到69.91 %和53.83%。然后构建了大豆 GmPUB8基因与其他物种PUB基因的系统化树(图1)。 实施例2大豆GmPUB8基因在不同器官中的表达特征 以大豆品种'科丰1号'为材料，利用实时荧光定量RT-PCR技术对大豆不同组织根、茎、 叶片、花及开花后不同时间茄果中的表达情况进行了研究。各组织总RNA的提取及cDNA第一 链合成同实施例1，具体步骤参照试剂盒说明书进行。根据GmPUBS基因序列设计实时荧光定 量PCR检测引物GmPUB8-qPCR-F: 5 ' -TCGTGTGCCCTATTTCATTAGAGC-3 '（ SEQ ID NO · 5)， GmPUB8-qPCR-R:5 '-TGCGGAGCGTGTGGTTCG-3 '（SEQ ID NO·6);内参基因采用大豆Actinl 1基 因 （Hu et al，2009，BMC Molecular Biology，10:93)，引物序列为八。衍111卜卩：5'-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3 '（SEQ ID NO.7)，Actin11-R:5 '-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3 ' (SEQ ID NO.8)。以来自不同组织的cDNA为模板进行实时荧光定量RT-PCR分析。 结果分析表明（图2)，GmPUB8虽然在不同组织中均有表达，但在根中的表达量最高，在 开花后5d幼荚中的表达量最低。 实施例3 GmPUB8基因的异源表达及泛素连接酶活性测定 一、 携带GmPUB8基因重组表达载体的构建 以大豆cDNA为模板，根据序列SEQ ID No.l设计引物，PCR扩增大豆PUB类E3泛素连接酶 GmHJB8基因编码区的DNA序列。引物两端分别引入Nhe I和Xho I酶切位点，引物序列为 GmPUB8-pET24b