唐氏综合征、囊性纤维 化、镰状细胞病、泰-萨克斯病、脆性X综合征、脊髓性肌萎缩症、血红蛋白病、地中海贫血、 X连锁疾病（由在X染色体上基因主导的疾病）、脊柱裂、无脑畸形、先天性心脏病、肥胖、糖尿 病、癌症、胎儿性别、或胎儿RHD。
[0146] 试剂盒
[0147] 在本申请的另一方面还提供了可用于基因组DNA扩增的试剂盒，其中包括含有第 一类引物和第二类引物的混合物，其中所述第一类引物从5'端到3'端包含通用序列和可变 序列，其中所述通用序列由G、A、C和Τ四种碱基中的三种或者两种组成，条件是所述通用序 列不同时包括G和C，并且所述第二类引物包含所述通用序列且不包含所述可变序列。
[0148] 在某些实施方式中，其中所述混合物进一步包括核苷酸单体混合物（例如dATP、 dGTP、dTTP、和dCTP)、dTT和Mg2+。在某些实施方式中，所述混合物的Mg2+浓度介于2111111〇1-81111]1〇1/^1^，(11^1 ：)浓度介于11111]1〇1-81]11]1〇1/^1^，(11'1'浓度介于21]11]1〇1-71111]1〇1/^匕在某些实施方式 中，所述混合物进一步包括一种或多种选自下组的成分:牛血清白蛋白（BSA)、pH调节剂(例 如Tris HCl)、DNase抑制剂、RNase、S〇42-、(：1-、1(+、〇32+、似+、和/或(順4) +等。在某些实施方式 中，所述混合物的pH值范围介于7.0-9.0之间。
[0149] 在某些实施方式中，试剂盒进一步包括核酸聚合酶，且所述核酸聚合酶不包含在 第一类引物和第二类引物的混合物中。在这样的实施方式中，核酸聚合酶可以存放于单独 的容器中，可选地可以与其他成分组成混合物，或者也可以是以基本上纯的形式存在。
[0150] 在某些实施方式中，所述第一类引物和第二类引物的混合物中进一步包括核酸聚 合酶。在某些实施方式中，所述混合物包括:第一类引物、第二类引物、核苷酸单体混合物、 Mg2+、dTT、Tris HC1、和核酸聚合酶，以及一种或多种选自下组的成分:BSA、DNase抑制剂、 1^86、3〇42'(：1_、1( +、0&2+、似+、和(順4)+等。在这样的实施方式中，所述混合物可以含有扩增 反应所需的除基因组DNA以外的全部反应物。当这样的混合物用于本申请所述的扩增反应 时，可以将含有基因组DNA的反应物与试剂盒中的混合物直接混合，可选地可以加入适量的 纯水以获得需要的反应体积，即可获得本申请方法的步骤(a)中的反应混合物。
[0151] 在某些实施方式中，试剂盒进一步包括能够裂解细胞的成分，例如一种或多种表 面活性剂，和/或一种或多种裂解酶。示例性的表面活性剂包括，但不限于，NP-40、吐温、 303、1^如1^-10040了4、异硫氰酸胍中的一种或多种。示例性的裂解酶可以是蛋白酶1(、胃 蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一种或多种。裂解细胞的成分可以单独存放于独立的容器中，也可 以与其他某些成分混合在一起。在某些实施方式中，试剂盒包括表面活性剂和裂解酶，两者 分别置于不同的容器中，或者置于同一个容器中。
[0152] 在某些实施方式中，所述第一类引物、第二类引物以及核酸聚合酶的混合物中进 一步包含表面活性剂和/或裂解酶。
[0153] 在某些实施方式中，所述试剂盒中包括一个容器，其中包含了所有的反应物。在某 些实施方式中，试剂盒中包括两个容器，其中一个容器存放包括核酸聚合酶在内的在扩增 反应中所需的成分，另一个容器存放包括裂解酶在内的在细胞裂解中所需的成分。在某些 实施方式中，试剂盒中包括四个容器，其中第一容器存放核酸聚合酶，第二容器存放除核酸 聚合酶以外的在扩增反应中所需的成分，第三容器存放裂解酶，第四容器存放除裂解酶以 外的在细胞裂解中所需的成分。
[0154] 在本申请的另一方面还提供了可用于基因组DNA扩增的试剂盒，所述试剂盒包括 第一类引物和第二类引物，并且还包括使用说明书，所述使用说明书记载了在开始进行所 述扩增之前在同一容器中混合所述第一类引物和所述第二类引物的步骤，其中所述第一类 引物从5'端到3'端包含通用序列和可变序列，其中所述通用序列由G、A、C和T四种碱基中的 三种或者两种组成，条件是所述通用序列不同时包括G和C，并且所述第二类引物包含所述 通用序列且不包含所述可变序列。试剂盒中的第一引物和第二引物可以分别置于不同的容 器中，但说明书中可以包括在开始扩增前将两者混合在同一容器中的步骤。
[0155] 具体实施例
[0156] 实施例1:单细胞基因组、阳性对照和阴性对照的获得
[0157] 单细胞基因组DNA:使用胰蛋白酶消化培养状态良好的人表皮成纤维细胞(AFP)， 将消化后的细胞收集进入1.5ml EP管内。将收集的细胞离心并用lx的PBS溶液冲洗。冲洗完 成后加入lx的roS使细胞悬浮。用移液器抽取一部分包含细胞的悬浮液，在10x显微镜下使 用口吸管挑取单细胞，吸取的PBS溶液体积不超过1微升，并将挑取的单细胞转移进入包含4 微升裂解缓冲液含有1^8-(：1、1((：^0了4、1^切11乂-100和如38611?1(^6386的？0?管内。短 暂离心后将PCR管置于PCR仪上执行裂解程序，具体程序如表1所示。
[0158] 表1:裂解程序
[0159]
[0160]阳性对照：用无核酸酶水将标准基因组DNA稀释为30皮克/微升的DNA溶液，取1微 升上述溶液加入到含有4微升细胞裂解缓冲液的PCR管中。标准基因组DNA为事先提取好的 人类细胞的基因组DNA。
[0161 ]阴性对照:将5微升细胞裂解缓冲液加入到PCR管中。
[0162] 实施例2:使用多次退火环状循环扩增(MALBAC)(简称为三步法)进行基因组扩增
[0163] 本实施例的方法在这里也称为三步法，因为基本上包括三个步骤，即：裂解细胞、 预扩增和指数扩增。
[0164] 按照实施1所述的方法对人表皮成纤维细胞进行分离和裂解，以获得单细胞基因 组DNA。使用江苏亿康基因科技有限公司的单细胞全基因组扩增试剂盒（货号YK001A/B)并 按照其产品说明书进行扩增。具体而言，按照30:1的比例混合预扩增缓冲液和预扩增酶混 合物以形成预扩增混合液。向分别包括待扩增样品(根据实施例1获得的基因组DNA、阳性对 照和阴性对照）的PCR管内分别加入30微升预扩增混合液。将PCR管放入PCR仪进行预扩增， 预扩增的程序如表2所示。
[0165] 表2:MALBAC三步法预扩增程序
[0166]
[0167]按照30:0.8的比例混合扩增缓冲液和扩增酶混合物以形成扩增混合液。向完成预 扩增后的PCR管中加入30微升扩增混合液，之后进行指数扩增，指数扩增的程序如表3所示。 [0168] 表3:MALBAC三步法指数扩增程序
[0169]
[0170] 实施例3:使用混合的引物(简称为两步法)进行基因组扩增
[0171]本实施例的方法在这里也称为两步法，基本上包括两个步骤，即：裂解细胞和扩增 反应。
[0172] 按照实施1所述的方法对人表皮成纤维细胞进行分离和裂解，以获得单细胞基因 组 DNA。
[0173] 配制扩增混合液，其中含有恥+、]\^2+、(：1-、1^8-(：1、1^仂1^-100、(1町？、￥61^聚合 酶、SEQ ID NO: 1所示的引物、SEQ ID N0:12所示的引物和SEQ ID N0:13所示的引物。
[0174] 本实施例中使用的引物根据如下原则设计：
[0175] 1.在引物的通用序列中仅包含三类自身互补配对能力较弱的碱基，如G，A，T.
[0176] 2.在引物可变碱基序列的3 '端(连续或不连续三个及以上碱基)使用1中提到的三 类碱基中的一种或几种，保证引物3'端与自身或不同引物的5'端不会产生互补配对的现 象。
[0177] 3.引物可变碱基序列在基因组上的识别位点经过统计计算，选择符合上述条件且 在基因组上分布更加均匀，覆盖度更高的序列，增加可变碱基序列与基因组DNA的识别机 会。
[0178] 4.引物通用序列中三类碱基的使用比例及组成方式经过特殊设计，保证通用序列 不会与基因组DNA结合产生扩增。分别向每个待扩增样品（根据实施例1获得的基因组DNA、 阳性对照和阴性对照）的PCR管内加入60微升扩增混合液。将PCR管放入PCR仪进行扩增，扩 增的程序如表4所示。
[0179] 表4:本申请两步法扩增程序
[0180]
[0181 ]实施例4:本申请两步法扩增产物与MALBAC三步法扩增产物的比较
[0182] 凝胶电泳
[0183] 分别取5微升未纯化的实施例2的三步法扩增产物和实施例3的两步法扩增产物， 并分别添加1微升6xDNA加样缓冲液(购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0610A) 准备上样。凝胶使用1%琼脂糖凝胶，标记物使用DM2000(购自北京康为世纪生物科技有限 公司，货号CW0632C)。
[0184] 电泳图请参见附图2,其中a为实施例3的两步法扩增结果，自左向右第1泳道为分 子量标记，2-11泳道为单细胞扩增样品，12-14泳道为阳性对照(40pg gDNA)，15-17泳道为 阴性对照（不含基因组DNA)，第18泳道为分子量标记;b为实施例2的三步法扩增结果，自左 向右第1泳道为分子量标记，2-11泳道为单细胞扩增样品，12-14泳道为阳性对照（40pg gDNA)，15-17泳道为阴性对照(不含基因组DNA)，第18泳道为分子量标记。电泳图显示:实施 例3的两步法扩增产物的条带和亮度与实施例2的三步法扩增产物的条带位置相当、亮度相 当，没有显著的差别，表明两步法扩增的准确性和得到的产物的产量与三步法的结果相当。
[0185] 纯化产物
[0186] 取50微升未纯化的实施例2的三步法扩增产物和实施例3的两步法扩增产物，使用 通用柱式纯化试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2301)对扩增产物进行 纯化处理，纯化步骤按照试剂盒说明书操作。使用50微升EB洗脱。纯化完成后取2微升纯化 产物使用Nanodrop(A0SHENG，NAN0-100)检测浓度。浓度检测结果如表5所示。
[0187] 表5:纯化后扩增产物的浓度 「01881
[0189]浓度检测结果显示:两种扩增方法获得的扩增产物在纯化后的浓度相当，没有显 著差别。 _〇] 致病位点检测
[0191]随机选取20个致病位点（选择的位点参见下表），并设计引物。选取的致病位点及 其相应的引物分别如表6和表7所不。
[0192]表6:第一批致病位点
[0193]
[0194] 表7:第一批致病位点相应的引物
[0195]
[0196] 随机选择根据实施例2扩增出的7个扩增产物以及根据实施例3扩增出的7个扩增 产物分别作为模板DNA。使用含染料的2xTaq MasterMix(购自北京康为世纪生物科技有限 公司，货号CW0682)进行PCR，分别扩增上述20个致病位点。扩增体系组成如表8所示，扩增程 序如表9所示。
[0197] 表8:用于致病位点检测的PCR反应体系 「01981
Luiyyj 衣9:用卞规炳怔点恆测的増桎斤
[0200]
[0201 ] *PKDHl-3681、PKDHl-1713、DMD-13exe、DMD-19exe 退火温度为 50 摄氏度，其余 16 个 引物退火温度为55摄氏度。
[0202]扩增的结果如图3所示。扩增结果显示:两种方法在扩增的准确性和扩增产物的量 上没有显著差别。
[0203]再次随机选取另外20个致病位点（选择的位点参见下表），并设计引物。选取的致 病位点及其相应的引物分别如表10和表11所不。
[0204] 表10:第二批致病位点
[0205]
[0206]表11:第二批致病位点相应的引物 [0207]
[0208]随机选择根据实施例2扩增出的3个样品（在图4中显示为2_1、2_3和2_7)以及根据 实施例3扩增出的3个样品(在图4中显示为3_1、3_4和3_8)分别作为模板DNA，使用含染料的 2xTaq MasterMix(购自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW0682)进行PCR扩增，分别 扩增上述20个致病位点。扩增体系和扩增程序分别如表8和表9所示，只是退火温度均选择 55摄氏度。
[0209]扩增的结果如图4所示。扩增结果显示:20个致病位点在上述两个扩增方法的扩增 产物中均能得到了很好地扩增，两种方法在扩增的准确性和扩增产物的量上没有显著差 别。
[0210] 质检引物q-PCR检测
[0211]随机选择根据实施例2的三步法扩增出的4个样品（在图5中示为3-5、3-6、3-9、3_ 1 〇)以及根据实施例3的两步法扩增出的4个样品（在图5中示为2-1、2-3、2-7、2-10)分别作 为模板DNA。使用如表14所示的6组质检引物，分别针对不同染色体上的DNA序列，对模板DNA 进行q-PCR检测。在荧光定量PCR中使用2xFastSYBR Mixture(购自北京康为世纪生物科技 有限公司，货号CW0955)。扩增体系组成如表12所示，扩增程序如表13所示。
[0212] 表12: q-PCR扩增体系 「02131
[0214] 表13: q-PCR扩增程序
[0215]
[0216] 表14:质检引物对
[0217]
[0218] 扩增的结果如图5所示，其中a-f分别表示针对染色体CH1、CH2、CH3、CH4、CH5、CH6 和CH7上的DNA序列，对模板DNA进行的q-PCR检测的数据。扩增结果显示：当用两步法和三步 法的扩增产物作为q-PCR的模板进行q-PCR时得到的Cr值相当，没有显著差别，表明q-PCR的 起始模板数没有显著差别，即两步法和三步法的扩增产物的量没有显著差别。而且6对质检 引物分别验证了染色体1、2、4、5、6、7上的不同序列，结果都一致显示两种起始模板量没有 显著差别。
[0219] 基因测序
[0220] 随机选取10个纯化后的实施例3的两步法扩增出的产物(在图6、图8和图9中示为 2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10)和10个纯化后的实施例2的三步法扩增出 的样品(在图 7、图8和图 9 中示为3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10)，使用打断 方法构建基因组文库，并采取浅测序的方式使用hi Seq2500测序仪进行测序，每个样品测定 1.5Mb的数据量，并将测序得到的序列比对到人类参考基因组(hgl9)上。
[0221] 实施例3的两步法的结果如图6所示，实施例2的三步法的结果如图7所示。其中纵 坐标代表染色体的拷贝数，正常人为2;横坐标代表染色体的1-22号染色体及性染色体。上 述结果表明：实施例2的三步法和实施例3的两步法对细胞的染色体检测结果一致。
[0222] 在测序结果中还提供了高通量测序结果的各个指标参数，如图8所示。其中原始数 据中"唯一比对到人类基因组的数据比例"（即，unique_mapped_of_raw)是最重要的衡量指 标，实施例3的两步法所有样品的平均unique_mapped_of_raw为74 · 15 %，而实施例2的三步 法所有样品的平均unique_mapped_of_raw为68 · 5 %，这表明实施例3的两步法扩增样品的 unique_mapped_of_raw的比例显著高于MALBAC三步法扩增样品。
[0223] 拷贝数变异系数可以用来比较两类扩增方法扩增样品后样品拷贝数的离散程度 的大小。实施例3的两步法所有扩增样品的平均拷贝数变异系数为0.1200,而实施例2的三 步法所有扩增样品的平均拷贝数变异系数为0.1205。两类扩增方法拷贝数变异系数相比无 明显差别。具体数据参见图9。
[0224] AD0 评价
[0225] 随机挑选150个SNP位点并设计相应的引物，挑选的位点以及相应引物参见表15。
[0226] 表15:150个SNP位点及其相应引物
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233] 为/衡量扩增给定位点的效率和等位基因脱扣率(ADO)，以确定扩增效率和扩增 是否成功，随机选取实施例2的三步法的两个扩增产物(3-1和3-2)，实施例3的两步法的一 个扩增产物(2-1)和人类表皮成纤维细胞(AFP)细胞提取的120ng DNA分别进行多重PCR，引 物参见表15。扩增体系的组成如表16所示，扩增程序如表17所示。
[0234] 表16:多重PCR扩增混合物
[0235]
[0236] 表17:多重PCR扩增程序
[0237]
[0238]对扩增产物采用打断建库方式构建基因组文库，使用hiseq2500测序仪测序，平均 测序深度为5Mb，统计结果参见图10。多重PCR数据表明：上述三种样本的扩增产物的GC含 量、高质量数据(high_qua 1 ity_of_raw)、原始数据特定map比率(unique_mapped_of_raw)， 以及平均覆盖度(average d印th)等各项指标参数无明显差距。
[0239]此外，二代测序分析结果显示，以gDNA为起始材料的多重PCR产物中共检测到纯合 位点23个，这23个纯合位点在实施例2的三步法的两个扩增产物中分别检测到23和22个;实 施例3的两步法的扩增产物中检测到21个，实施例2的扩增产物和实施例3的扩增产物纯合 位点的AD0比例无显著差别。具体数据参见表18。
[0240]表18: gDNA纯合位点中实施例3扩增产物与实施例2扩增产物的AD0比较
[0241]
[0242] 二代测序分析结果显示，以gDNA为起始材料的多重PCR产物中共检测到杂合位点 62个，这62个杂合位点在实施例2的两个样品中分别检测到59和56个;实施例3的一个样品 中检测到51个，实施例2的扩增产物和实施例3的扩增产物杂合位点的AD0比例无显著差别。 具体数据参见表19。
[0243] 表19: gDNA杂合位点中实施例3扩增产物与实施例2扩增产物的AD0比较
[0244]
[0245] 实施例5:使用裂解和扩增一步完成的方法(简称为一步法)进行基因组扩增
[0246] 本实施例的方法在这里也称为一步法，因为其中将裂解细胞、预扩增和指数扩增 合并在一个步骤中完成。
[0247] 按照实施1所述的方法对人表皮成纤维细胞进行分离和裂解，以获得单细胞基因 组 DNA。
[0248] 配制扩增混合液，其中含有恥+、]\^2+、(：1-、1^8-(：1、(1町？、1^切1^-100、￥61^聚合 酶、SEQ ID NO: 1所示的引物、SEQ ID N0:12所示的引物和SEQ ID N0:13所示的引物。
[0249] 向每个待扩增样品(根据实施例1制备的阳性对照和阴性对照，以及未裂解的单细 胞)的PCR管内加入50微升扩增混合液。将PCR管放入PCR仪进行扩增，扩增的程序如表20所 不。
[0250] 表20:本申请一步法扩增程序
[0251]
[025