高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养及诱导技术领域，具体涉及一种高效诱导大豆子叶节外 植体产生丛生芽的方法及培养基。
【背景技术】
[0002] 大豆原产我国，是目前世界上重要的油料作物及经济作物，并且是植物蛋白的重 要来源。常规育种生产的大豆已不能满足社会需求，需要进行转基因遗传育种来生产高产 具抗逆作用的大豆新品种。但大豆遗传转化技术一直属于植物基因工程领域的难点，受到 多方面因素的限制，其中最主要的限制因素是大豆转化子叶节外植体的适当处理及之后丛 生芽的快速大量诱导。如何提高大豆转化子叶节外植体的诱发速度并在短期内高效获取大 量优良的丛生芽是技术瓶颈。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生 芽的方法及培养基，解决了现有技术中诱导大豆子叶节外植体时间长、出芽率低的问题，填 补了技术空白，将该方法应用于相关的遗传转化研究和生产工作中，为转基因研究提供了 重要的技术平台和支持。
[0004] 本发明是这样实现的，根据本发明的一个方面，提供了一种高效诱导大豆子叶节 外植体产生丛生芽的培养基，包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉）乙磺酸(MES)0.5~1.5g/ L，鹿糖20~30g/L，谷氨酰胺40~60mg/L，天冬酰胺40~60mg/L，6-节氨基噪呤0 · 5~2mg/L， 琼脂6~8g/L，pH值为5.6~5.8。
[0005] 进一步地，培养基包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉）乙磺酸lg/L，蔗糖25g/L，谷 氨酰胺50mg/L，天冬酰胺50mg/L，6-节氨基噪呤lmg/L，琼脂6 · 5g/L，pH值为5 · 8。
[0006] 根据本发明的另外一个方面，提供了高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方 法，包括如下步骤：
[0007] 1)按照上述配方配置培养基；
[0008] 2)大豆种子消毒灭菌及萌发，将大豆种子先用乙醇消毒5-10分钟，再用过氧化氢 消毒15-30分钟，最后用灭菌水清洗3-5遍，之后再在大豆种子中加入灭菌水，放入4 °C下静 置培养至长出5-8mm胚轴；
[0009] 3)大豆子叶节外植体的制备，将步骤2)中长出5-8mm胚轴的大豆种子剥去种皮，切 去部分胚轴，留下带有3-5mm上胚轴的大豆种子，沿胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3-5mm上胚轴和顶端分生组织的大豆子叶节，即得到大豆子叶节外植体；
[0010] 4)丛生芽的诱导，将步骤3)中制备的大豆子叶节外植体接入步骤1)制备的培养基 中，置于温室中培养，培养温度为24-26°(：，湿度为50-70%，光照强度为1500-200011?，光照 时间为16h，7-10天后得到具有2-5株丛生芽的子叶节外植体；
[0011] 5)大量丛生芽的诱导，将步骤4)中获得的长有2-5株丛生芽的子叶节外植体取出， 切除大丛生芽，继续将其置于步骤1)中配置的培养基上并于温室中培养，培养温度为24-26 °C，湿度为50-70%，光照强度为1500-20001ux，光照时间为16h，培养10-15天后获得具有 20-40株丛生芽的子叶节外植体。
[0012]进一步地，步骤2)中乙醇的体积分数为70-80%。
[0013] 进一步地，步骤2)中过氧化氢的体积分数为15-20%，并且用过氧化氢给种子消毒 时，将种子置于25-28°C振荡培养箱中黑暗振荡，转速为100-200r/min。
[0014] 进一步地，步骤2)中将大豆种子消毒灭菌后，再加入的灭菌水的量为刚没过大豆 种子即可，将加有灭菌水的大显种子培养14_18h，长出5_8mm胚轴。
[00?5]进一步地，步骤4)中将大豆子叶节外植体插入所述培养基中的方式为斜插，子叶 叶面朝上。
[0016]进一步地，步骤5)中切除的大丛生芽长度为2-4cm。
[0017] 与现有技术相比，本发明的优点在于:将消毒灭菌后的大豆种子4°C静置培养，可 在缩短萌发培养时间的同时减去萌发培养基的消耗;培养基各成分的配比及种子预处理， 能够提供优良的可供遗传转化的外植体，经诱导后可诱导出大量优良健壮的丛生芽，且获 得时间为20-25天，并且具有污染率低、丛生芽状态良好的优点，与现有技术诱导大豆丛生 芽需要30-50天相比，本发明建立的大豆外植体快速高效诱导丛生芽体系能够极大的缩减 大豆萌发时间及丛生芽的获得时间，为以大豆子叶节为转化外植体为基础的高效扩繁体系 及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0019] 图1为利用本发明的方法制得的具有2-5株丛生芽的子叶节外植体；
[0020] 图2为利用本发明的方法制得的具有20-40株丛生芽的子叶节外植体。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0022] 为了解决现有技术中诱导大豆丛生芽外植体时间长、诱导率低的问题，本发明提 供了一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基，以大豆子叶节为外植 体，在20-25天培育出具有大量丛生芽的外植体。本发明所用材料、药品均为市售。
[0023] 实施例1、
[0024] 1)配置培养基，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES 0.5g，蔗糖25g，谷氨酰胺 50mg，天冬酰胺50mg，6-节氨基噪呤1.3mg，琼脂6.5g，加热完全溶解，调节培养基pH值为5.6 ~5.8之间，高压灭菌，待温度降低至60°C时倒平板，冷却备用，上述操作均在无菌状态下进 行，其中MSB基本培养基的成分如下：
[0027] 2)大豆种子消毒灭菌及萌发，在超净工作台里，将挑选出的优良大豆种子置于灭 过菌的三角瓶中，加入体积分数70-80%乙醇消毒5-10分钟后，倒出乙醇沥干后再向大豆种 子中加入体积分数15-20 %的过氧化氢，置于25-28 °C振荡培养箱中黑暗振荡消毒15-30分 钟，转速为100-200r/min，然后用灭菌水清洗3-5遍，最后加入灭菌水没过种子，放入4°C冰 箱静置培养过夜，培养时间为14_18h;
[0028] 3)大豆子叶节外植体的制备，在超净工作台上，用镊子将已长出5~8mm胚轴的大 豆种子取出置于灭菌培养皿中，剥去种皮，用解剖刀切去一部分胚轴，留3~5mm上胚轴，沿 胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3-5mm上胚轴和