NA。采用通用引 物（27f: 5，-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3，；1492r: 5，-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）进行 16S rDNA的PCR扩增，扩增体系（50ul):lXTaq PCR Master Mix 25yL，DNA 模板 lyL(O.l-lOng)，引物（10ymol/L)各 2 yL，ddH20 20μΙ^ΡΟ?反应条件为：94°C 预变性 4min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2 min，30个循环；72°C延伸 10 min，4°C终止反 应。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，于_20°C冰箱保存，送至生工生物工程(上海)有限 公司进行纯化，双向测序并拼接输出全序列。
[0020] 将获得的DNA序列（见Seql)，通过NCBI数据库中的Blast检测并下载已测序列的相 似序列和参考序列。运用软件Clu StalX(Versi〇n 1.83)对多序列进行比对。选取其中6个典 型菌株的16SrDNA序列，以小单抱菌属种类Micromonospora viridifaciens为外群，运用 分析软件M e g a 6.0 6中的邻位相连法进行系统发育树构建。结果表明，菌株D T J - 2 4与 Streptomyces lavenduIae聚类在一个分支上（图2)。因此，结合形态、生理生化特征及 16SrDNA系统发育分析结果，将菌株DTJ-24鉴定为淡紫灰链霉菌(S. Iavendulae)。
[0021] 实施例3拮抗菌无菌发酵滤液的制备 将菌株DTJ-24接种于液体培养基中，培养基装量70%，发酵罐体积30L，在搅拌速度150-200rpm/min、通气量15-20%、温度25-30°C、pH值6.5~7.5条件下，进行恒温发酵培养，发酵5 天后，发酵液5000r/min离心处理，制备上清液，上清液采用无菌滤膜过滤，制备无菌发酵滤 液。
[0022]液体培养基配方如下：酵母浸粉4.0g/L，麦芽浸粉10.0g/L，葡萄糖4.0g/L，水 1000ml，pH值7.5。
[0023] 实施例4盆栽试验 为了检验菌株DTJ-24无菌发酵滤液对软枣猕猴桃干腐病的生防效果，进行了本试验。 试验于2015年4-6月进行，试验用软枣猕猴桃苗1年生，生长势均一，栽培基质为软枣猕猴桃 栽培基地土壤，栽培装置为营养钵(规格30cm X 30cm) 〇
[0024] I、软枣猕猴桃移植 自辽宁丹东软枣猕猴桃种植基地挖土备用。称取适量土，混入2 %有机肥，每个营养钵 中装入3.5公斤混土。在营养钵中装满基质后略压紧，然后移入1株软枣猕猴桃苗，根据需要 补充水分，15d后待软枣猕猴桃生长稳定进行后续试验。
[0025] 2、病原菌孢子悬液制备 将软枣猕猴桃干腐病病原菌接种于PDA试管斜面中27°C培养7d。取已培养好的病原菌 斜面菌种一支，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，该孢子悬浮液置于已灭菌 50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用 无菌水冲洗滤渣2~3次，最终使滤液体积达到10.0 ml，得孢子悬浮液。用血球计数板测孢子 悬液浓度，最终制备5.0 X IO5个/ml的病原菌孢子悬液。
[0026] 3、拮抗菌无菌发酵滤液的制备:方法见实施例2。
[0027] 4、病原菌感染软枣猕猴桃 用无菌刀片在健康的试验软枣猕猴桃树干部位划出0.5cm长十字伤口，用移液器在软 枣猕猴桃树干划伤部位接种5ul步骤2中制备的病原菌孢子液，培养48h。
[0028] 5、茎部喷施防效 用步骤3制备的无菌发酵滤液100倍稀释液进行茎部喷施，将药液均匀的喷洒在茎部， 以滴水为度;无菌水喷施作为阴性对照;咪鲜胺1000倍稀释液喷施作为阳性对照。每个处理 组20株，3次重复。每隔15天喷药1次，连续喷施3次，于45d后统计病情指数，计算防治效果， 结果见表1。
[0029] 6、灌根处理防效:用步骤3制备的无菌发酵滤液100倍稀释液100mL进行灌根处理； 无菌水处理作为阴性对照；咪鲜胺1000倍稀释液处理作为阳性对照。每个处理组20株，3次 重复。每隔15天用药1次，连续处理3次，于45d后统计病情指数，计算防治效果，结果见表2。
[0030] 软枣猕猴桃干腐病树干的病情分级标准0级:无病；1级：发病部出现浅褐色斑点， 病斑平均长度<1.0 cm;3级:病斑沿树干方向向两侧扩大，病斑平均长度在1.1~5.0 cm;5 级：出现典型的病斑，病斑平均长度在5.1~9.0 cm:7级:病斑扩大，平均长度为9.1~15.0 cm;9级:发病树干的叶片出现萎蔫，病斑平均长度>15 · 0 cm〇
[0031] 病情指数=[Σ (各级病株数X对应各级值)/(调查总株数X发病最高级值）]X 100。相对防效(％)=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]X 100。
[0032]表1茎部喷施防治效果
注:表中数据为平均值±标准差，数据后相同字母表示经邓肯新复极差法检验差异不 显著（Ρ>0·05) 表2灌根处理防治效果_
注:表中数据为平均值±标准差，数据后相同字母表示经邓肯新复极差法检验差异不 显著（Ρ>0·05) 由表1、2可见，菌株DTJ-24无菌发酵滤液100倍稀释液与化学农药咪鲜胺1000倍稀释液 处理相比无明显防效差异，且防治效果良好。两种不同的施用方式:茎部喷施和灌根处理均 能达到较好的防治效果。因此与施用化学农药相比，本发明工艺简单，成本低，使用方便，可 以降低软枣猕猴桃栽培过程中化学农药的使用，具有安全环保的优点及良好的应用和开发 前景。
【主权项】
1. 一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐病中的应用。2. 权利要求1所述的应用，其特征在于，一株淡紫灰链霉菌的无菌发酵滤液用于防治软 枣猕猴桃干腐病。3. 权利要求2所述的无菌发酵滤液用于防治软枣猕猴桃干腐病，其特征在于，施用时， 将无菌发酵滤液按比例1:100与水冲兑后，直接喷施于软枣猕猴桃茎部或灌于软枣猕猴桃 根部。
【专利摘要】本发明公开了一株淡紫灰链霉菌在防治软枣猕猴桃干腐病中的应用，涉及农业生物技术领域。本发明的一株淡紫灰链霉菌保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC？No.9972。本发明使用一株淡紫灰链霉菌的无菌发酵滤液100倍稀释液直接喷施于软枣猕猴桃茎部或灌于软枣猕猴桃根部，对软枣猕猴桃干腐病防效可达88.6%。本发明工艺简单，成本低，使用方便，可以降低软枣猕猴桃栽培过程中化学农药的使用，具有安全环保的优点，及良好的应用和开发前景。CGMCC No.997220141114
【IPC分类】A01P3/00, A01N63/02
【公开号】CN105638746
【申请号】
【发明人】李娟 , 王旭, 王东来
【申请人】辽东学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月26日