一种治疗乳腺癌的car-t细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]在肿瘤免疫治疗方法中，过继性免疫效应细胞治疗因具有众多的优点而受到人们的重视。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen RecepTor，CAR)修饰T细胞(CAR-T)作为过继免疫细胞治疗的新领域更是成为研究热点。癌症病人因放、化疗导致的免疫系统功能低下，是导致病情复发的重要原因，也是困扰医学界的一大难题。CAR-T细胞疗法则是一种全新的生物免疫治疗方法，通过提取患者体内T淋巴细胞，经过体外10至14天的培养改造，通过载体整合进入到正常T细胞基因序列，形成嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。被重新编码的T细胞就能获得特异性识别和攻击杀伤肿瘤细胞的能力，能精确杀伤肿瘤细胞，但又不会伤及正常细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有通常放、化疗的毒副反应，也没有传统治疗中出现的耐药性。
[0003]CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号传导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为:胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。胞外抗原结合区:通常由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区:对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。因此针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。跨膜区:来自CD3、CD28、CD8的跨膜区常用来构建CAR，并在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区:由共刺激分子如⑶28、CD134和⑶137组成，其中⑶28可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性；CD134能促进T细胞体外增殖且增加白介素-2的分泌;CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK，p38，MAPK和NF-kB信号途径。大多数研究者把⑶28或⑶137的协同共刺激信号分子融合到CD3结构域的上游。根据胞内信号传导区域的组成不同可分为3代CAR-T细胞。第
I代CAR-T细胞的胞内部分仅含CD3G结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短且只有很低或者没有白介素-2的产生;第2代CAR-T细胞将共刺激分子如CD28、CD 137的胞内部分融合到CD3结构域的上游，效果比第I代明显增强因而应用最广泛;第3代CAR-T细胞则同时融合2种共刺激分子到CD3结构域的上游，其抗肿瘤活性与第2代CAR-T细胞相比尚无定论。CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以⑶19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，有些已经进入Π期临床试验。CAR-T细胞在实体肿瘤中的研究大部分仍处于动物实验阶段，但有一些小样本的临床试验和病例报道取得了不错的疗效。
[0004]乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，随着我国人口城市化的加速，乳腺癌发生率及病死率有逐年上升的趋势。乳腺癌的常规治疗方法主要有:手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗。近年来综合治疗提高了乳腺癌的治疗效果，但仍有相当一部分患者复发或对常规治疗耐药。因此找到一种新的治疗方法以降低乳腺癌患者的复发和提高治疗效果，具有特别重要的临床意义。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂及其制备方法，对干乳腺癌的治疗具有特别重要的临床意义。
[0006]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现:
一种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂是由嵌合了靶细胞抗原受体的CAR-T细胞、人血白蛋白、IL-6受体措抗药物TociIizumab、生理盐水按一定比例配制而成。
[0007]进一步的，所述细胞注射液的具体组成为:CAR-T的浓度为(4?6)X 17个/ml，质量体积比为2%的人血白蛋白、8mg/mL IL-6受体措抗药物Tocilizumab，余量为生理盐水。
[0008]进一步的，所述CAR-T细胞的革E细胞抗原为如下单一抗原或几个抗原的组合:CA153人表皮生长因子受体-2(HER2)、组织因子(TF)、表皮生长因子受体(EGFG)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，优选HER2和CA153的组合。
[0009]进一步的，所述CAR-T细胞的CAR是HCA153-HER2scFv-CD8-0X40-CD3G，CAR的具体组成为:抗原抗体结合区HCA153-HER2scFv、CD8铰链区、0X40跨膜区和胞内区以及CD3G胞内信号区串联构成。
[0010]进一步的，所述CAR-T细胞由一种表达载体所表达，其中，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒中的一种，优选慢病毒。
[0011]—种治疗乳腺癌的CAR-T细胞制剂的制备方法，主要包括以下步骤:
(1)载体构建:构建能够表达HCA153-HER2scFv-CD8-0X40-CD3G的载体；
(2)转染T细胞的病毒的包装:采用步骤(I)中构建的载体包装慢病毒，获得经过包装的慢病毒；
(3)T细胞分离与扩增培养:抽取患者自身血液，从中分离出T细胞并进行扩增培养；
(4 )Τ细胞的转染与制备:采用步骤(2 )中经过包装的慢病毒对步骤(3 )中培养所得T细胞进行转染并扩增培养，获得CAR-T细胞；
(5)将步骤(4)制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、IL-6受体拮抗药物Tocilizumab按比例混匀，余量用生理盐水补足，制备成CAR-T细胞制剂。
[0012]本发明相对于现有技术具有以下优点和效果:
(1)本发明首次将嵌合了乳腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞，用来治疗乳腺癌，治疗效果显著，从根本上提供了一种治疗乳腺癌的方法；
(2)本发明首次将嵌合了乳腺癌细胞抗原受体的CAR-T细胞与人血白蛋白、IL-6受体拮抗药物Toci I izumab等联合制作成一种革El向治疗乳腺癌的免疫细胞制剂，Toci I izumab可以有效缓解患者在输入CAR-T细胞后来带的炎症反应;人血白蛋白可以维持CAR-T细胞的活性。本制剂成分明确，制作简便，为CAR-T细胞的临床推广应用提供了更便捷的方法；
(3)本发明所选用的靶细胞抗原为如下单一抗原或几个抗原的组合:CA153、人表皮生长因子受体_2(HER2)、组织因子(TF)、表皮生长因子受体(EGFG)、血小板衍生生长因子受体(roGFR)，优选CA153和HER2的组合。CA153是乳腺癌的最重要的特异性标志物。30%-50%的乳腺癌患者的CA153明显升高，其含量的变化与治疗效果密切相关，是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标;HER2是乳腺癌预后不良的重要独立因素，24%?30%的乳腺癌组织中存在HER2受体过度表达，其过度表达导致肿瘤细胞异常增殖、侵袭性和转移危险增加，因此采用CA153和HER2的组合作为靶细胞抗原可以大大提高使CAR-T细胞特异性识别和杀伤乳腺癌细胞的能力，降低乳腺癌患者的复发和提高治疗效果；
(4)本发明采用的是第三代CAR，第三代CAR的重组T细胞能够增加γ -干扰素和抗细胞凋亡蛋白的分泌，在抗肿瘤活性、存活周期及细胞因子释放方面均显著提高；
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施案例并配合附图详细说明如后。本发明的【具体实施方式】由以下实施例及其附图详细给出。
【附图说明】
[0013]图1表示从患者外周血分离得到的T细胞体外培养扩增曲线。
[0014]图2体外培养扩增所得T细胞的活力测定。
[0015]图3显示用不同MOI值的慢病毒感染T细胞的感染效率(用FITC-标记的蛋白检测s cFv在T细胞上的表达率)。
[0016]图4显示CAR-T细胞对CAl 53和HER2表达阳性的乳腺癌细胞T47D的特异性杀伤率。
【具体实施方式】
[0017]实施例1 CAR-T细胞表达载体构建: (1沖011扩增目的片段抗04153和!^2抗体以?00熟3-808￥431 /26-hFc质粒为模板设计引物，在其5 ’、3 ’端分别加上Nhe 1、Sal I限制性内切酶