灯盏花甲素的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物的提取分离领域，尤其涉及一种从灯盏细辛中得到灯盏花甲素单 体的提取方法。
【背景技术】
[0002] 5，4 ' -二羟基黄酮-7-0-D-葡萄糖醛酸又名灯蓋花甲素（apigenin-7-〇-0-D-glucuronide)，是从菊科植物短葶飞蓬(又名灯蓋细辛）[Erigeron breviscapus(Vant.) Hand-Mazz]中提取而得的一种黄酮苷类化合物，灯盏花甲素具有如式I所示结构：
[0003]
[0004] 分布于多种天然药用植物体中（如：灯蓋细辛（Erigeron breviscapus)、苦碟子 (Ixeris sonchifolia)、拳卷地钱（Marchantia convolute)，哥兰叶（Celastrus gemmatus)，多裂委陵菜（Potentilla multifida)牛至（Origanum vulgare)，水飞蓟 (silybum marianum)、苦苣菜（Sonchus oleraceus L.)，福寿草(Adonis amurensis)等中。
[0005]灯蓋细辛（灯蓋花）（Erigeron breviscapus(Vant · )Hand. -Mazz)为菊科飞蓬属草 本植物，主要分布于云南省，民间广泛用于治疗中风后遗症、风湿病、胸痹等症，取得了较好 效果。植物药提取物灯盏花素(包括灯盏花甲素和乙素，其中主要成分为灯盏花乙素)作为 药典中的原料药单独成药，归在2015版药典一部植物油脂和提取物章节。
[0006]灯盏花甲素多作为灯盏花乙素(野黄芩苷）的相关物质。而灯盏花甲素的活性也有 报道:灯盏花甲素具有明显的抗溃疡的作用和抗急性食管炎及胃炎的作用。对血管性老年 痴呆有一定疗效。
[0007] 灯盏花甲素虽然存在于多种植物中，并且具有一些活性。然而由于其在植物中含 量较低，例如灯盏花乙素在灯盏细辛中含量高的可以达到3-4%，而灯盏花甲素的含量就只 有0.3-0.5%，所以大量制备比较困难。导致其生物活性等报道也较少。
[0008] 现有的文献及专利也大多只涉及灯盏花乙素的纯化，而灯盏花甲素作为其中的有 关物质成分需要去除。灯盏花甲素的纯化文献报道是用自合成酰胺基化大孔树脂分离，此 树脂市面上稀少，仅作为研究使用。且不同丙烯酸甲酯在树脂中的比例也是需要控制的。
【发明内容】
[0009] 为了克服现有技术中灯盏花甲素的提取方法存在的缺陷，本发明提出了一种工艺 简单、易操作、快速、高效、产品纯度高的芍药苷单体的提取方法。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下。
[0011] 本发明提供了一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，包括如下步骤：
[0012] (1)灯盏细辛加入乙醇或水回流提取2-3次，合并提取液，减压浓缩成浸膏；
[0013] (2)将灯盏细辛浸膏用浓度为0.1-20%的稀碱溶液溶解至pH 7-10之间，使浸膏溶 解后，过滤;滤液加酸调pH值至1-3，静置后过滤;得到沉淀；
[0014] (3)将沉淀用碱溶解，调节pH值6-9之间，上苯乙烯型大孔树脂层析柱，用水冲洗， 分别接收洗脱液，以液相检测，收集灯盏花甲素相对含量大于60%及以上的馏分。将含有灯 盏花甲素的洗脱液部分减压浓缩成清膏；
[0015] (4)将含有灯盏花甲素的清膏上制备液相柱，以有机溶剂和含有酸的水作为流动 相，进行纯化分离，收集灯盏花甲素纯品，检测波长为:270-335nm，收集保留时间在10分钟 以后的馏分，该馏分为灯盏花甲素纯品。
[0016] 优选的，所述步骤（1)中的乙醇含量为0-95 % ;优选50%-80 %的乙醇溶液;更优选 65 %的乙醇溶液。该百分比为体积百分比。
[0017] 除非特殊说明，本发明所涉及的百分含量表示法均为业内常规的百分含量的表示 方法。
[0018] 优选的，所述步骤(2)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸氢 钾，氢氧化钾中的一种或几种。所述步骤(2)中加入的酸为盐酸，硫酸或者磷酸。
[0019] 优选的，所述步骤(3)中的碱溶液为为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸 氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。
[0020] 优选的，所述步骤(3)中苯乙烯型大孔树脂为D101，DA201，D301，D401，D141，D160， AB-8HPD100，HPD450或HPD600;
[0021] 更为优选的，所述步骤(3)中洗脱液洗脱顺序为色素，灯盏花乙素，灯盏花甲素。
[0022] 以液相检测结果为监测指标，收集灯盏花甲素相对含量大于60%的馏分。
[0023] 更为优选的，所述步骤(4)中制备液相柱为C18反相硅胶填充柱。
[0024]更为优选的，所述步骤(4)中洗脱液中有机溶剂为甲醇，乙醇或者乙腈中的一种， 含酸的水相为〇. 01-1 %的甲酸或者乙酸水溶液;有机溶剂与酸水的比例为10-70%。
[0025]更为优选的，所述步骤(4)中保留时间为10分钟至90分钟，10分钟之前很难得到甲 素纯品，原则上90分钟以后也可以，但是在工业上应用意义，因此，优选10-90min;当检测波 长为270-335nm，流速为40ml/min时，收集馏分进行纯化分离，收集保留时间在20-28min的 馏分，该馏分为灯盏花甲素纯品。
[0026]更为优选的，所述的步骤(4)中梯度洗脱条件为：以62:38的含0.5%甲酸的水-甲 醇为流动相，检测波长270-280nm，流速40ml/min，收集20-40分钟馏分；或者以82:18的含 0.1 %甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长320-335nm，流速30ml/min，收集25-45分钟馏分； 或者以50:50的含1%乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长33511111，流速5〇1111/1^11，出峰时间 18min;收集15-45分钟馏分。
[0027]更为优选的，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以62:38的含0.5%甲酸的水-甲醇 为流动相，检测波长270-280nm，流速40ml/min，收集20-30分钟馏分；或者，以82:18的含 0.1 %甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长320-335nm，流速30ml/min，收集26-38分钟馏分； 或者以50:50的含1%乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长33511111，流速5〇1111/1^11，出峰时间 18min;收集18-28分钟馏分。
[0028]在本发明的优选实施例中，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水(含0.5%甲酸)_ 甲醇62:38为流动相，检测波长:270-280nm，流速:40ml/min，收集20-30分钟馏分。
[0029]在本发明的另一优选实施例中，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水(0.1%甲 酸)-乙腈82:18为流动相，检测波长:320-335nm流速:30ml/min，出峰时间：26min。收集26-38分钟馏分。
[0030] 或者，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水（1 %乙酸)-甲醇50:50为流动相，检测 波长:335nm流速:50ml/min，出峰时间：18min。收集18-28分钟馏分。
[0031] 有益效果:本发明提供的一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，碱溶酸沉得到黄 酮成分，主要为灯盏花乙素和灯盏花甲素，再通过苯乙烯型大孔树脂富集灯盏花甲素，最后 通过制备型高效液相色谱制备得到纯度大于98%的灯盏花甲素纯品。
[0032] 与文献报道方法相比有如下优点：
[0033] (a)本方法先用碱溶酸沉法富集黄酮类成分，将灯盏细辛中大量咖啡酸酯类等其 他成分去除，
[0034] (b)用苯乙烯类大孔树脂富集灯盏花甲素，溶剂仅用水冲洗，具有经济，安全性。杂 质，灯盏花乙素，灯盏花甲素依次从柱子上下来，在分离灯盏花甲素的同时，可以得到纯度 较高的灯盏花乙素。
[0035] (c)用制备型高效液相分离，可以按比例具有损失低，产品纯度高的特点；该半制 备的色谱条件可同比放大，适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度灯 盏花甲素的工业化生产。
[0036] 步骤1:灯盏细辛提取后浸膏得到黄酮及咖啡酸酯类等成分，其中灯盏花乙素相对 含量为37%，灯盏花甲素相对含量为9%，高效液相检测图如图1所示。
[0037]步骤2:灯盏细辛浸膏经过碱溶酸沉后富集了黄酮类物质，灯盏花乙素的相对含量