猴srv1病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物技术领域的检测方法及抗原技术领域，具体涉及一种猴SRV1 病毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猴D型反转录病毒(simian type-Dretro virus，SRV)属反转录病毒科、D型反转录 病毒属，与猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus, SIV)同为猴获得性免疫缺 陷综合征（SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有5个血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主 要的靶细胞是淋巴细胞，感染后可造成淋巴细胞耗竭，诱发免疫缺陷。各型SRV的发生有其 种属性和群体性，一旦传入易感猴群，可使80%以上的猴发病致死。SRV自然宿主是猕猴，而 我国是世界上猕猴的一个主要分布区，遍及东南各省，尤其是海南、云南、广西、四川、贵州 和福建等省区，每年都有一定数量的猕猴出口欧美地区，同时也从东南亚地区进口一定数 量的猕猴。自美国从中国进口的猴子中分离到SRV-5病毒以来，我国也开始了对国内猕猴 SRV的检测。SRV感染的诊断除了检查临床症状，还要结合实验室诊断方法，常用的实验室诊 断方法有聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光（IFA)、免疫印 迹(Western Blot)、病毒分离等。
[0003] 免疫梳方法是能够对病毒血清抗体进行定性、定量检测的一项新型体外诊断技 术，这种技术突破性地将病毒抗原点布在具有极强蛋白吸附力的硝酸纤维膜上，把包被好 的抗原膜贴附于PVC板以增加膜的强度和硬度，经机器裁切制成免疫梳。将此免疫梳插入稀 释好的待检血清样本时，特异性抗体与抗原结合并固着于膜上，再通过酶标二抗底物反应， 染色后，抗体阳性的样本表现为肉眼可见的红色斑点，阴性则无颜色变化。膜经过图像处理 系统数据化后可以进行定量分析。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种猴SRV1病 毒抗体的免疫梳检测试纸及制备方法和应用。
[0005] 本发明是通过以下的技术方案实现的： 1、一种用于构建猴SRV1病毒抗体的免疫梳的S0E-PCR引物组，引物SRV1F:如序列表Seq No. 1所示，引物SRV1R:如序列表Seq No. 2所示。
[0006] 2、一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体PGEX-4T- SRV1，序列 如序列表Seq No.3所示。
[0007] 3、一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T- SRV1的构建 方法，包括如下步骤： (1) 根据猴SRV1病毒的基因序列，设计S0E-PCR扩增引物，引物SRV1F:如序列表Seq No. 1所示，引物SRV1R:如序列表Seq No. 2所示； (2) 进行S0E-PCR扩增猴SRV1病毒基因； (3) 猴SRV1病毒基因的回收； (4) 克隆质粒pMD18T- SRV1的构建及测序； (5) 表达载体pGEX-4T-SRVl的构建，序列如序列表SeqNo.3所示。
[0008] 4、如上所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体PGEX-4T-SRV1的构建方法，所述的步骤(2 )采用S0E-PCR反应的具体步骤如下： 将混合液在95 °C预变性5 min，94 °C变性1 min，63 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，30 个循环，72 °C总延伸10 min; 上述混合液如下所示:_
5、如上所述的一种用于制备猴SRV1病毒抗体的免疫梳的重组表达载体pGEX-4T-SRVl 的构建方法，所述的步骤(5)pGEX-4T-SRVl的构建方法具体步骤如下：利用EcoRI与XhoI分 别将PMD18T-SRV1和pGEX-4T-l进行双酶切，并胶回收酶切的目的片段，将回收的目的片段 进行连接，将连接产物转化到BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选阳 性菌落，并提取质粒进行Smal和EcoRI双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒命名为pGEX-4T-SRVl〇
[0009] 6、一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法，包括如下步骤： (1) 以重组表达载体PGEX-4T-SRV1表达猴SRV1病毒蛋白； (2) 猴SRV1蛋白的纯化与定量； (3 )免疫梳检测试纸的制备： (3.1) 将步骤（1)中表达的猴SRV1病毒蛋白以0.1 mg/mL的浓度进行线性包被NC膜，将 膜晾干； (3.2) 用0.05g/mL的BSA封闭液封闭NC膜过夜，弃去封闭液后再次晾干； (3.3) 将包被好的NC膜裁剪成标准尺寸的试纸条，依次按一定间距整齐固定于PVC板 上，十二条为一组或直接裁剪包被好的NC膜制成免疫梳检测试纸，最终于自封袋中低温保 存备用。
[0010] 7、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸的制备方法制备的一种猴 SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸。
[0011] 8、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸，其检测方法如下： (1) 将1:25倍稀释的待检血清样品转移至96孔酶标反应板中，标记顺序号； (2) 将免疫梳检测齿依次伸入各反应孔内的血清液面之下，37 °C轻轻震荡30-60 min； (3) 取出免疫梳用TBS-T缓冲液冲洗三次，每次3-5 min，同时将稀释好的碱性磷酸酶标 记1:500兔抗猴二抗溶液顺次加入另一排酶标反应板孔中，每孔2 300 yL，将洗过的免疫梳 依次伸入各反应孔中，37 °C震荡30-60 min; (4) 取出免疫梳按上述方法冲洗3次后置于干净的方盒中加入显色液，静止、闭光显色 1-15 min，最后用蒸馏水冲洗免疫梳并观察记录反应结果； (5) 上述操作过程中设立阳性对照与阴性对照各1孔； (6) 阳性对照免疫梳齿上有明显的肉眼可见反应条带，蓝紫或黑色，且阴性对照梳齿上 无反应条带，说明检测有效，在此基础上进行下一步待测样品的判定； (7) 待测样品检测的免疫梳齿上与阳性对照梳齿上相同位置处出现可见反应条带的判 定为阳性检测结果，若待测样品检测的免疫梳齿上无反应条带出现则判定为阴性检测结 果。
[0012] 9、如上所述的一种猴SRV1病毒抗体的免疫梳检测试纸在检测猴SRV1病毒抗体中 的应用。
[0013] 本发明提供了一种不需要特定仪器设备辅助的检测试纸，解决了目前进出口实验 猴SRV1病毒抗体检测缺乏现场操作简便的试剂盒的现状，能够应用于大规模现地检样的检 测。该试纸具有快速、简便、经济、不需任何特殊仪器，保留了常规ELISA的敏感、特异的优 点，又克服了许多繁琐的操作，节省了操作时间，缩短了实验周期，完全可在野外进行实地 诊断检测，达到快速诊断的目的，能够满足□岸机场、码头的快速通关检测，具有良好的运 用推广前景。
【附图说明】
[0014] 图1为猴SRV1病毒抗原表位基因的PCR扩增结果图， 其中，M:DNA Marker 2000; 1:水对照;2:猴SRV1病毒抗原表位编码基因 PCR扩增结果。
[0015] 图2为猴SRV1病毒抗原表位基因重组表达载体的酶切鉴定结果图， 其中，M:DNA Marker DS 5000 Ladder; l:SmaI+EcoRI 双切质粒pGEX-4T-SRVl;2:质粒 PGEX-4T-SRV1 图3为猴SRV1病毒表位抗原蛋白的SDS-PAGE分析结果图， 其中，1 -3:空载体菌诱导对照;Μ:蛋白Mar ker (kDa )位置;4:诱导的pGEX-4T-SRV 1 图4为猴SRV1病毒表位抗原蛋白的纯化结果图， 其中，M:蛋白分子量Marker位置；1:切胶纯化后的猴SRV1病毒的重组表达蛋白SRV1-30 图5为重组猴SRV1病毒SRV1-30蛋白最佳包被量确定图， 其中，分别代表SRV1-30包被浓度即，lmg/mL、0 · lmg/mL、0.01mg/mL、lyg/mL、100ng/ mL、1Ong/mL和1ng/mL 图6为Western-blot分析重组猴SRV1病毒SRV1-30蛋白特异性结果图， 其中，1-5分别代表SRV1-30蛋白与猴SRV1病毒阳性血清、猴B病毒阳性血清、猴SIV病毒 阳性血清、猴STLV1病毒阳性血清以及猴MeV病毒阳性血清免疫反应结果。
[0016] 图7为重组猴SRV1病毒SRV1-30蛋白敏感性分析结果图， 其中，1-6分别代表SRV1-30蛋白与1:25/50/100/200/400/800倍稀释的猴SRV1病毒阳 性血清反应结果。
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