马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明专利涉及一种microRNA(miRNA)及其筛选方法和应用，具体地说是马铃薯stu-miR4322及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002]miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，长约20 nt的内源性非蛋白编码RNAt3HiiRNA基因最初转录产生具有莖环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定革E基因的mRNA结合，通常在转录后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
[0003]干旱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，其对农作物的生长发育和产量造成极其严重的影响。据统计，地球上总土地面积的36%属于缺水的干旱或半干早区域，我国干旱和半干早区域大约占国土地面积的1/2。即使在半湿润和湿润的农业主产区，也通常会受到季节性和周期性的旱灾侵袭。干旱胁迫对农作物产量、质量的影响相当于其余自然灾害之和，其危害性在各种自然逆境胁迫中占首位，仅次于病虫害对作物造成的损失。解决干旱问题的途径，除了节水灌溉来提高水分的利用效率之外，就是培育节水抗旱的新品种以提高作物自身抵御干旱的能力。要达到这一目的，必须了解作物响应干旱胁迫的分子机制。因此，对作物抗旱机理的研究以探索提高作物抗旱能力是各国科学家关注的研究热点问题。尤其是近年来对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鉴定、克隆出大量耐旱相关的基因，已研究清楚了一些耐盐相关的基因的调控模式。将抗旱、耐盐基因通过基因工程的手段整合到目标植物基因组中或有目的的抑制或诱导一些干旱相关基因的表达来获得转基因植株，开辟了培育高度抗旱性作物新品种的新途径。随着对植物抗旱机理的了解以及转基因技术的日趋成熟，利用转基因技术来获得抗旱的育种材料或遗传改良的新品种，已成为抗旱品种培育最具发展潜力的方向。
[0004]干旱等非生物胁迫往往会产生共同的次生胁迫，如氧化胁迫，会导致植物细胞的代谢不协调，细胞内过氧化物的过度积累，过度积累的活性氧将会攻击脂肪、核酸及蛋白质等大分子物质，产生大量的无功能蛋白垃圾，对植物造成的次生伤害。在逆境条件下，植物为了维持正常的生命代谢稳态，在漫长的进化过程中已经演化形成一套抵御逆境胁迫的作用机制。如APX是植物体内最为主要的过氧化物清除酶之一，也被认为是在叶绿体中清除H2O2的关键酶，有研究显示，转APX基因并过量表达的转基因烟草和拟南芥都表现出对氧化胁迫更强的耐受能力；同时也有研究发现过表达APX的转基因棉花具有较高的PSII光化学活性和较强的抗氧化能力，从而大大提高了转基因植株对逆境胁迫的适应能力。这可能是由于APX过量表达会保护Cal vin循环防止了 AsA被氧化。另外，最近通过研究了缺失APX的突变体也进一步证明了 APX在植物抵抗逆境胁迫中起着重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供马铃薯stu-miR4322的前体序列、stu-miR4322抑制靶基因表达以研究靶基因功能的应用、stu-miR4322抑制靶基因表达提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品种的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
马铃薯stu-miR4322的前体序列如下(本发明中所列核苷酸序列均为5,—3'):ggguucgcuuggggccaguaauggucuccgagugccgguccagcccaggguguaggcucagggcgugacauccagaucacgcucugcaaggcccauucgaggguagca(序列表SEQ ID NO:1)。
[0007]马铃薯stu_miR4322的前体序列的二级结构式为:自5'端3bp_5bp和55bp_58bp形成环状，自5'端25bp-34bp形成环状;其他碱基配对形成茎环结构。
[0008]编码上述马铃薯stuiiR4322的前体序列的DNA序列为:gggttcgcttggggccagtaatggtctccgagtgccggtccagcccagggtgtaggctcagggcgtgacatccagatcacgctctgcaaggcccattcgagggtagca(序列表SEQ ID NO:2)。
[0009]上述马铃薯stu_miR4322的成熟序列如下:cccaggguguaggcucagggcgug (序列表SEQ ID N0:3Xstu-miR4322的成熟序列是前体序列自5'端44bp-67bp的一段RNA序列。
[0010]上述马铃薯stu-miR4322的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR4322抑制靶基因APX基因(PGSC0003 DMG400030063)的表达，所述APX基因序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[0011]上述马铃薯stu-miR4322的前体序列在培育抗旱转基因植物中的应用。
[0012]优选地，所述转基因植物为马铃薯(Solanum tuberosum)0
[0013]优选地，在马铃薯中过表达SEQ ID NO:1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO:1所述miRNA的表达，培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯。
[0014]采用上述技术方案所产生的技术效果在于:本发明提供了一种马铃薯Stu-miR4322及其筛选方法和应用。RLMHACE测检结果表明stu-miR4322调控APX基因(PGSC0003 DMG400030063)，可用于研究该APX基因的功能，即通过缺失表达或过表达该APX基因时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR4322的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
【附图说明】
[0015]图1是本发明马铃薯stu-miR4322的二级结构图。
[0016]图2是本发明马铃薯靶基因降解电泳图。
[0017]图3是本发明马铃薯靶基因降解组测序图。
[0018]图4是本发明马铃薯stu-miR4322的荧光定量PCR图。
【具体实施方式】
[0019]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对【具体实施方式】进行详细说明。本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0020]在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，以下实施例仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本发明所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得;所有定量试验均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0021]实施例一:stu-miR4322和靶基因序列的确认
马铃薯stu-miR4322的前体序列如下(本发明中所列核苷酸序列均为5,—3'):ggguucgcuuggggccaguaauggucuccgagugccgguccagcccaggguguaggcucagggcgugacauccagaucacgcucugcaaggcccauucgaggguagca(序列表SEQ ID NO:1)。
[0022]马铃薯stu_miR4322的前体序列的二级结构式为:自5'端3bp_5bp和55bp_58bp形成环状，自5'端25bp-34bp形成环状;其他碱基配对形成茎环结构。
[0023]编码上述马铃薯stuiiR4322的前体序列的DNA序列为:gggttcgcttggggccagtaatggtctccgagtgccggtccagcccagggtgtaggctcagggcgtgacatccagatcacgctctgcaaggcccattcgagggtagca(序列表SEQ ID NO:2)。
[0024]上述马铃薯stu_miR4322的成熟序列如下:cccaggguguaggcucagggcgug (序列表SEQ ID N0:3Xstu-miR4322的成熟序列是前体序列自5'端44bp-67bp的一段RNA序列。
[0025]上述马铃薯stu-miR4322的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR4322抑制靶基因APX基因(PGSC0003 DMG400030063)的表达，所述APX基因序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[0026]实施例二:stu-miR4322 的制备 1、马铃薯材料处理
选取大小均匀完整的马铃薯栽培品种“紫花白”和“大西洋”的薯块，然后将整薯盆栽种植于标准温室进行培养;每个品种平行种植六盆，当植株长到20厘米左右时，每个品种随机的选取3盆进行干旱处理，剩余的3盆按时浇水使其正常生长。当处理一月后。分别采集马铃薯干旱处理和对照植株新鲜的叶片，并立即在液态氮中速冻，被储存在-80°C冰箱。
[0027]2、样品总RNA提取与检测
(I)将采样的马铃薯叶片在液氮中快速研磨成粉末，在液氮尚未挥发之前将大约100mg的粉末立即转入预冷的DEPC处理过的1.5ml离心管中，快速加入Iml的Trizol溶液，涡旋震荡充分混勾后室温放置5?1min，使核酸与核蛋白完全分离。
[0028](2)4°C ,12000 r.min—1离心10 min，小心的将上清液转移到另一个DEPC处理过的
1.5ml离心管中。
[0029](3)加入200 μ?的氯仿，涡旋振荡混匀，室温放置5min。
[0030](4)4°C，12000 r.min—1离心10 min后，小心的将上层水相转移至另一个DEPC处理过的1.5ml离心管中，切记勿吸取中间有机相。
[0031](5)分离后加入相同体积的异丙醇，充分混匀再于室温放置15 min。
[0032](6)4°C ,12000 r.min-1 离心 10 min，废弃上清，可得到RNA沉淀;
(7)按2 ml 75%乙醇/ml Trizol的比例加入75%乙醇(DEPC水稀释)，温柔的振荡离心管，洗涤沉淀(重复一次)。
[0033](8)4°C ,12000 r.min-1离心5 min，弃掉上清，切不可倒出沉淀。
[0034](9)室温放置5?10 min自然干燥，注:RNA样品不要太过于干燥，否则很难再完全溶解。
[0035](10)用40 μ?无RNase的ddH20溶解RNA沉淀，55?60 °(:水浴处理5?10 min。将溶解好的RNA分装于1.5 mL无Rnase的离心管中，置于_80°C超低温冰箱保存。
[0036](Il)RNA样品的检测:琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop检测RNA的纯度(0D26Q/28()比值);Qubit对RNA浓度进行精确定量；Agilent 2100精确检测RNA的完整性。
[0037]3、miRNA文库的构建及测序
提取的RNA经检测合格后，分别使用small RNA Sample Pre Kit构建smRNA文库，利用smRNA的3'财端的特殊结构(5'端完整的磷酸基团，3'端有羟基)，使用RNA连接酶在纯化后的smRNA 37端加上接头，添加反转录引物，防止多余3'接头与5'接头连接，减少接头自连产物;再加5'接头，添加反转录酶将上述smRNA反转录成cDNA。随后用PCR扩增，然后扩增产物用PAGE胶电泳分离目标片段，切胶回收得到的为cDNA文库。以此cDNA文库为模板在11 Iumina测序仪中进行PCR扩增测序。miRNA分离、文库构建和高通量测序应用11 IuminaHiSeq 2500测序仪完成。
[0038]4、测序数据分析和miRNA筛选
将测序获得50 nt左右的序列经去除低质量的reads、去除5'接头污染的reads、去除没有3'接头序列的reads以及含有poIyA的reads，获得clean reads数据。将clean reads与genbank和Rf am数据库以及参考基因组进行比对，获得不同sRNA的注释信息。然后进行序列长度分布统计以及样品之间公共序列统计分析，miRNA主要集中在20-24 nt的范围。除注释的所有miRNA片段，选取剩下的未注释miRNA片段进行已知miRNA的鉴定和