一种提取2′，3′-环形核苷单磷酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提取2'，3'_环形核苷单磷酸的方法，特别涉及一种利用重组蛋白 从大肠杆菌工程菌中同时提取腺苷-2 '，3 ' -环形单磷酸、鸟苷-2 '，3 ' -环形单磷酸、胞苷_ 2 '，3 ' -环形单磷酸和尿苷-2 '，3 ' -环形单磷酸四种2 '，3 ' -环形核苷单磷酸的方法，属于生 物技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 环形核苷酸是细胞内重要的第二信使，参与细胞内多种信号转导途径的调控。第 二信使学说是E.W.萨瑟兰1965年提出，他认为人体内各种含氮激素(蛋白质、多肽和氨基酸 衍生物)都是通过细胞内的环形腺苷酸(3'，5' -cAMP)而发挥作用的，并把3'，5' -cAMP称为 第二信使，这是最早发现的环形核苷酸类第二信使。随后，研究人员在多种生物细胞内发现 了环形鸟苷酸(3?-cGMP)，环形胞苷(3?-cCMP)，环形尿苷酸(3?-cUMP)，环形二鸟 苷酸（c-di-GMP)，环形二腺苷酸(c-di-AMP)及环形鸟苷腺苷酸(cGAMP)等均可作为第二信 使参与胞内信号通路的调控。除了3' ,δ'-环形核苷单磷酸之外，埃德温(Edwin)等人还首次 在人的肾脏细胞中发现了腺苷_2'，3'_环形单磷酸(2' J'-cAMP)，随后人们又在哺乳动物 的大脑等组织细胞中发现了腺苷-2'，3'_环形单磷酸的存在。科研人员还从植物细胞中检 测到腺苷_2'，3'_环形单磷酸和鸟苷_2'，3'_环形单磷酸(2' J^cGMP)，从一株荧光假单胞 菌中检测到胞苷_2'，3'_环形单磷酸（2' J'-cCMP)和尿苷_2'，3'_环形单磷酸（2' cUMP)的存在。有关2' 环形核苷单磷酸生理功能的研究较少，现有的研究结果认为，2'， 环形核苷单磷酸与组织细胞的损伤有一定的关系，在受损的组织细胞内，2' 环形核 苷单磷酸的含量会明显升高;腺苷-2 '，3 环形单磷酸具有激活细胞线粒体膜上通透性孔 洞的作用，引起细胞凋亡;研究还发现与正常的脑部细胞相比，感染了HIV病毒的脑部细胞 内2' 环形核苷单磷酸降解酶的磷酸化水平更高。2'，3'_环形核苷单磷酸（2' cNMPs)与细胞损伤的密切相关性激发了科研人员越来越大的兴趣。
[0003] 随着2' 环形核苷单磷酸吸引了越来越多的关注，其在科学研究和医学应用上 将有更多的需求。目前2'，3'_环形核苷单磷酸的制备均采用化学合成的方法，产量低，价格 高，从而极大限制了其开发应用。
【发明内容】
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[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用重组IF3蛋白与四种2' 环形单 磷酸的相互作用快速制备四种2'，3~环形核苷酸的方法。该方法无需特定的前体物质，利 用微生物的生长从头合成四种2'，3~环形核苷单磷酸，并利用一种重组蛋白快速地将微生 物合成的四种2'，3~环形核苷单磷酸提纯。
[0005] 本发明技术方案如下：
[0006] -种提取2'，3'_环形核苷单磷酸的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)提取大肠埃希氏菌(Escherichia coli)K12菌株的基因组DNA，利用PCR扩增编 码IF3蛋白的基因 if3，制得基因 if3;
[0008] 所述PCR特异引物序列如下：
[0009] F:GGAATTCCATATGATTAAAGGCGGAAAACG，
[0010] R:CCGCTCGAGCTGTTTCTTCTTAGG；
[0011] (2)将步骤(1)制得的基因 if 3酶切后与同样经酶切的表达质粒PET-22b连接，然后 转化到E.coli BL21(DE3)菌株中，进行发酵培养，制得重组菌发酵液；
[0012] (3)分离步骤(2)制得的重组菌发酵液中的菌体，破碎细胞，镍柱亲和层析提纯重 组蛋白IF3，然后0 °C静置2.5~3.5d，固液分离，取上清液；
[0013] ⑷将步骤⑶制得的上清液经超滤去除蛋白杂质，滤液经Cl8反向色谱柱进行高效 液相分离，分别制得含四种2 '，3 环形核苷单磷酸溶液。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PCR扩增体系(50μυ如下： 灭菌蒸馏水 _ 32.2 5x7'runsSturtFu乂tPfu 始'\'施 10 μL. dNTP混合物 5 μΕ
[0015] 引物F (50μΜ) 0.4 μL 引物R (50 μΜ) 0.4 μL 基因组DNA 1 pL Γα7/7、-5>6"Υ fVv."/3,? DNA.聚合酶 1 μL
[0016] PCR反应条件如下：
[0017] 95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72 °C终延伸5min。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中酶切采用限制性内切酶Ndel和Xhol进行双酶 切，酶切反应体系如下： 缓冲液 2 μΙ_ 表达质粒PET-22b或基因 if3 8 yiL
[0019] 限制性内切酶Ndel 1 gL 限制性内切酶Xhol ΙμL 灭菌蒸馏水 8 μΕ
[0020] 反应条件:37°C温浴30min。
[0021 ]根据本发明优选的，所述步骤(2)中连接的反应体系如下：
[0022] 酶切后的载体pET-22b lyL
[0023] 酶切后的基因if 3 4yL
[0024] Solution I 5yL
[0025] 反应条件:16 °C连接过夜。
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中，发酵培养步骤如下：
[0027] 先在35~38°C、150~200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm吸光度为0.8; 然后在18~22°C、100~140rpm继续培养30min;再加入终浓度为O.lmM的IPTG，继续诱导培 养22~25小时；
[0028]所述发酵培养基为淡水LB培养基，组分如下：
[0029] lOg NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，pH 8.0,蒸馏水定容至1L。
[0030] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，破碎细胞步骤如下：
[0031]将分离得到的菌体重悬于裂解缓冲液中，在压力为950~1050bar的条件下破碎细 胞，12000rpm离心50min，取上清液；
[0032]所述的裂解缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0。
[0033] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中，镍柱亲和层析提纯重组蛋白IF3步骤如下：
[0034] 将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每 根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，用20mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10mL的洗脱缓冲液洗脱，制 得重组蛋白IF3溶液；
[0035] 所述裂解缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH 8.0;
[0036] 所述冲洗缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、20mM咪唑，pH 8.0;
[0037] 所述洗脱缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH 8.0。
[0038] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤管超滤。
[0039] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中，所述C18反向色谱柱进行高效液相分离的分离 程序为：〇min，B液0% ;2.5min，B液0%;5min，B液30%;10min，B液60% ;14min，B液 100% ; 21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min，B液0% ;流速为 10ml/min，检测波 长为254nm;
[0040] 流动相为:A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0;B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混 合。
[0041 ] 有益效果
[0042] 1、本发明提供的方法首次实现了从大肠杆菌中同时直接提取四种2'，3'_环形核 苷单磷酸。通过微生物生物发酵，从头合成四种2' 环形核苷单磷酸，不需要特定的前体 物，无化学合成法的污染，简单方便，每升培养液可提取5mg的四种纯品2'，3'_环形核苷单 磷酸；
[0043] 2、本发明采用大肠杆菌进行生物发酵，由于其遗传背景清楚、生长速度快，有利于 进一步采用生物工程方法进行改进，提高产量。
【附图说明】
[0044] 图1、镍柱亲和层析纯化的重组蛋白IF3的电泳图。
[0045]图中:M、蛋白质分子量标记(marker) ;IF3、镍柱亲和层析纯化后的重组IF3蛋白；
[0046] 图2、提取含4种2'，3'-环形核苷单磷酸溶液的HPLC分析；
[0047] 图3、纯化得到的2'，3' -cCMP液相色谱和质谱分析；
[0048] (a)，液相色谱分析纯化得到的2\3~cCMP;
[0049] (b)，一级质谱分析纯化得到的Y，3~cCMP，图谱显示提纯的Y，3~cCMP的质荷比 为306.0491 (z = 1 )，与理论值306.0491完全相符；
[0050] (c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为306.0491(z = l)的离子，片段化方 式如(d)所示；
[0051] ((1),27 J'-cCMP结构示意图；
[0052]图4、液相色谱，质谱分析纯化得到的2' J^cUMP;
[0053] (a)，液相色谱分析纯化得到的2'彳-cUMP;
[0054] (b)，一级质谱分析纯化得到的2' J'-cUMP，图谱显示提纯的2' J'-cCMP的质荷比 为307.0331 (z = 1 )，与理论值307.0331完全相符；
[0055] (c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为307.0331(z = l)的离子，片段化方 式如(d)所示；
[0056] ((1),27 J'-cUMP结构示意图；
[0057]图5、液相色谱，质谱分析纯化得到的2' J^cGMP;
[0058] (a)，液相色谱分析纯化得到的2\3~cGMP;
[0059] (b)，一级质谱分析纯化得到的Y，3~cGMP，图谱显示提纯的Y，3~cCMP的质荷比 为346.0552 (z = 1 )，与理论值346.0552完全相符；
[0060] (C)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为346.0552(z = l)的离子，片段化方 式如(d)所示；
[0061] ((1),27 J'-cGMP结构示意图；
[0062]图6、液相色谱，质谱分析纯化得到的2' J^cAMP;
[0063] (a)，液相色谱分析纯化得到的2' ,3' -cAMP;
[0064] (b)，一级质谱分析纯化得到的2' J-cAMP，图谱显示提纯的2' y-cCMP的质荷比 为330.06 (z = 1 )，与理论值330.0603极为相符；
[0065] (c)，二级质谱分析一级质谱中得到的质荷比为330.06(z = l)的离子，片段化方式 如(d)所示；
[0066] ((1),27 J'-cAMP结构示意图。
【具体实施方式】
[0067] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0068]实施例中所述大肠杆菌K12菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，地址:北 京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，菌种保藏号CICC 10424;
[0069]大肠杆菌BL21(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司，地址:北京市海淀 区西小口路66号中关村东升科技园B-3号楼四层。
[0070] 实施例1
[0071] -种重组蛋白表达菌株构建方法，步骤如下：
[0072] 1.大肠杆菌转录起始因