一种用于检测样品中新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光rt-pcr引物、探针和试剂盒 ...的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于体外核酸检测领域，尤其涉及一种用于检测样品中新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光RT-PCR引物和探针和试剂盒及检测方法，可用于新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的辅助诊断和流行病学研究。
【背景技术】
[0002]猪蓝耳病是1987年在美国被发现的，很快传到了加拿大、德国、欧洲国家。猪蓝耳病不是人畜共患病，不传染人，该病在上世纪90年代中期传入我国，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国列为二类动物疫病。
[0003]普通猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reprodu c t i ve andrespiratorysyndrome,简写PRRS)是非变异美洲株毒株猪蓝耳病病毒引起的猪的接触性传染病，是以成年猪的生殖障碍、早产、流产、死胎为特征，一般发病率很高，死亡率较低。
[0004]高致病性猪蓝耳病，是2006年我国发生“猪高热病”后才提出的新概念，是高致病性猪繁殖与呼吸综合征(High pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome)的俗称，是指由一定程度变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Highpathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV)弓丨起的一种高发病率、高死亡率、低治愈率的猪病，与经典的蓝耳病在临床特征和病原核酸分子水平有明显的区别，其变异主要表现在GP5基因的点突变和Nsp2基因缺失。
[0005]2012年之后河南新乡、焦作、鹤壁、周口以及其他地区发现新的变异性高致病性猪蓝耳病病毒株，该新变异型病毒同样具有高致病性，同时与2006年的高致病性猪蓝耳病病毒具有明显不同的遗传背景，经研究表明新变异型病毒如henan-xinx、henan-xinx-1、HENAN-XINX-2、HENAN-JIA0Z、HENAN-HEB 株与美国 NADC30、MN184C 等高度同源，与经典的PRRSV毒株相比存在较大的基因缺失，同时基因缺失部位和缺失的核苷酸数量又与2006年HP-PRRSV明显不同，在进化树中均位于美国NADC30、MN184c等毒株为代表的亚群3中。因此该变异型高致病性猪蓝耳病病毒可能是由于国外引种输入国内后再与中国经典高致病性猪蓝耳病病毒发生基因重组后产生的新变异型。目前市场的疫苗依然不能很好地控制蓝耳病的发生，PRRSV在不断的发生变异，新的变异型HP-PRRSV也在不断出现，其对我国养猪业发展的影响应当引起高度的关注，但是国内尚未研发出针对于这种新的变异型高致病性猪蓝耳病病毒快速检测试剂盒。
[0006]目前国内申报的关于检测高致病性猪蓝耳病病毒检测试剂盒相关专利全都针对于2006年发现的的高致病性猪蓝耳病病毒株进行的设计，例如:
[0007]公开号:CN101343670A专利名为《高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR快速检测试剂盒》针对于2006年高致病性猪蓝耳病病毒株相关序列设计一对普通的RT-PCR引物，建立了一套常规PCR检测方法试剂盒，该试剂盒并不能检测2012年之后新的变异型高致病性猪蓝耳病病毒。
[0008]公开号:CN104711369A专利名为《高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法》虽然采用实时荧光定量PCR技术，能够快速检测2006年高致病性猪蓝耳病病毒株，但是依旧不能检测之后新的变异型高致病性猪蓝耳病病毒，造成漏检和误检。
[0009]公开号:CN104745726A专利名为《猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒三重荧光定量检测试剂盒》采用三重实时荧光定量PCR技术，能够快速检测猪蓝耳病病毒、2006年高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒，但是依旧不能区分2012年后新的变异型高致病性猪蓝耳病病毒，容易造成误检和误判。
[0010]实时荧光定量PCR技术，通过引入特异性探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。
[0011 ]本专利基于实时荧光PCR技术建立针对于2012年后新变异型高致病性猪蓝耳病病毒核酸快速检测方法以及检测试剂盒，能够快速准确的区分普通猪蓝耳病病毒、2006型高致病性猪蓝耳病病毒、2012年后新变异型高致病性猪蓝耳病病毒，对于进一步猪蓝耳病病毒分子流行病学研究、相关疾病防治等具有很好的促进作用。
【发明内容】
[0012]本发明目的之一是针对于现有市场上提供的猪蓝耳病病毒检测试剂盒的不足，提供一种用实时荧光RT-PCR技术检测2012年后新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，该荧光RT-PCR引物和荧光探针是针对于新变异型高致病性猪蓝耳病病毒NSP2基因相对缺失序列区域为靶标区域设计一对特异性引物及荧光探针。
[0013]本发明目的之二是提供一种基于上述荧光RT-PCR引物和荧光探针建立的核酸检测试剂盒，该检测试剂盒可以快速、定性检测样本中的2012年后新变异型高致病性猪蓝耳病病毒。
[0014]本发明目的之三是提供一种基于上述荧光RT-PCR引物和荧光探针建立的检测方法。
[0015]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:
[0016]—种用于检测新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于，荧光RT-PCR引物和荧光探针为针对新变异型高致病性猪蓝耳病病毒NSP2基因相对缺失序列区域设计的特异性新变异型高致病性猪蓝耳病病毒正、反向引物和荧光探针。
[0017]在本发明的一个优选实施例中，所述新变异型高致病性猪蓝耳病病毒正向、反向引物和焚光探针序列分别是:
[0018]新变异型高致病性猪蓝耳病病毒正向引物如下:
[0019]5 ’-CAGGACTGTGTCCCAACTGAAG-3’
[0020]新变异型高致病性猪蓝耳病病毒正向引物如下:
[0021 ] 5’-GCACGCCAGAGTCCCTACC-3’
[0022]荧光探针:5’-CCAGCCCCTGTGCCCGCACCA-3 ’ ；
[0023]所述荧光探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有不同的荧光报告基团。
[0024]在本发明的一个优选实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、J0E或R0X、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red ;所述荧光淬灭基团选自 BHQ、TAMRA、Ecl ipse、Dabcyl、Lowa Black? RQ或Lowa Black? FQ0
[0025]上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，同时还可以向5’端和3’端方向延伸一至十个碱基或删减一至十个碱基得到的序列。
[0026]—种TaqMan探针法荧光RT-PCR检测新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒，其包含RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阴性质控品、阳性质控品，其中RT-PCR反应液含有dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、内标正向、反向引物、内标探针和上述检测新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的特异性正向、反向引物和荧光探针、含有镁离子的缓冲液；
[0027]在本发明的一个优选实施例中，所述内标正向、反向引物和内标探针序列分别是:
[0028]内标正向引物:5，-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3’
[0029 ]内标反向引物:5 ’ -GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3 ’
[0030]内标探针:5，-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3’ ；
[0031]所述内标探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
[0032]在本发明的一个优选实施例中，所述荧光报告基团选自FAM、NEX、ROX、TET、TAMRA、J0E、VIC、CY3、CY5或Texas Red;所述荧光淬灭基团选自BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、LowaBlack? RQ或Lowa Black? FQ0
[0033]在本发明的一个优选实施例中，所述的酶混合液为包含有热启动的TaqDNA聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)的缓冲液。
[0034]在本发明的一个优选实施例中，所述的阳性质控品为含有插入新变异型高致病性猪蓝耳病病毒特异性保守序列的PUC57载体质粒的无菌TE缓冲液，所述阳性质控品的浓度为I.0 X 106copies/ml。
[0035]在本发明的一个优选实施例中，所述的含有插入新变异型高致病性猪蓝耳病病毒特异性保守序列的PUC57载体质粒的无菌TE缓冲液是将含有插入新变异型高致病性猪蓝耳病病毒特异性保守序列的PUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5a中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释后得到。
[0036]在本发明的一个优选实施例中，所述新变异型高致病性猪蓝耳病病毒特异性保守序列为:
[0037]
CAGGACTGTGTCCCAACTGAAGCCGTCACCGATGACGCCAGCCCCTGTGCCCGCACCACGACGAAGACTTCAGCAAA