一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，属于实验 室技术领域。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒Π 型(PCV2)引起的一类猪病的总称，主要包 括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征和母猪的繁殖障 碍症。PCVD现已在全世界范围内发生和流行，其发病率可达60%，死亡率3%-10%，发病严 重地区猪场在暴发本病时死淘率达到40%左右，给世界养猪业带来了巨大的损失。为控制 猪圆环病毒的流行传播，目前，商品化的全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗已在世界各地养猪 场应用，并取得较好的效果。但是这些疫苗接种成本较高，并不能完全阻断PCV2的传播。
[0003] Fenaux 等（0022-538X(2003)20-11232-12)用 PCV2 的 0RF2 基因替换 PCV1 的 0RF2 基 因成功构建出对猪无致病性但有感染力的嵌合型猪圆环病毒1-2,并能诱导猪体产生针对 PCV2的特异性抗体。研究表明嵌合型PCV1-2疫苗免疫猪群，能快速产生细胞免疫和体液免 疫应答，有效抵御PCV2各种亚型的混合感染，并且可作为PCV2疫苗的候选毒株。
[0004] 目前，国内外无市售检测PCV1-2的试剂盒，又因 PCV1-2与亲本PCV1和PCV2高度同 源，传统PCR方法和荧光定量方法很难将三者区分开，只能通过测序鉴定。Opriessnig等 (0264-410X(2010)37-5960-7)建立了 PCV1-2 的 TaqMan 荧光定量 PCR 检测方法，其使用 CAL Fluor Orange 560作为5'端报告基团，但是国内这种焚光染料标记探针需要进口，价格高 达万元，且合成的探针难以获得常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所以，在国内针对该 病毒的鉴定面临费时、费力、费用高等问题，不能快速定量该病毒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法。 本发明通过对定量检测PCV1-2的TaqMan荧光定量PCR检测方法进一步的探索，设计了针对 PCV1-2的特异性引物和探针，建立了PCVl_2TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法对于 PCV1-2的检测特异性、灵敏度很高，与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪其 它常见病毒核酸模板不发生交叉反应。
[0006] 实现本发明目的的技术解决方案是：
[0007] 设计一对嵌合型PCV1-2的特异性引物，横跨PCV1的0RF1和PCV2的0RF2，特异性的 扩增Ραα-2基因291bp的条带，同时，在此区域PCV1的0RF1中设计一条以6-FAM荧光染料作 为5'端报告基团的TaqMan探针，并构建重组质粒T easy-PCVl-2-P，优化qPCR的反应条件和 反应体系，建立嵌合型猪圆环病毒l_2TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体方法如下：
[0008] -种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法，包括以下步骤：
[0009] (1)引物设计：设计一对引物横跨PCV1的0RF1和PCV2的0RF2区，并设计TaqMan探 针；
[0010] (2)PCVl-2 病毒 DNA 的提取；
[0011] (3)重组质粒Teasy-PCVl-2-P的构建:将步骤(2)中获得的病毒DNA使用步骤(1)设 计的引物进行扩增，然后将得到的目的片段连入pGEM-TEasy载体，获得重组Teasy-PCVl-2-P质粒；
[0012] (4)优化PCVl-2TaqMan实时荧光定量PCR反应条件及反应体系：通过比较探针浓 度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率的影响，优化荧光定量PCR反应条件及反应体 系；
[0013] (5)建立定量PCR的标准曲线：将步骤(3)获得的重组质粒DNA作为定量PCR阳性模 板，用超纯水以10倍稀释度进行倍比稀释，将其作为模板，用步骤(4)优化后的反应条件和 体系进行TaqMan实时荧光定量PCR;
[0014] (6)荧光定量PCR特异性的检测：以步骤(3)获得的重组质粒作为阳性对照，同时以 其它非靶病毒DNA或cDNA为模板，超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体 系进行TaqMan实时荧光定量PCR，观察是否有非特异性扩增；
[0015] (7)荧光定量PCR敏感性的检测：将Teasy-POa-2-P重组质粒106-10。个拷贝数/μL 为模板，以超纯水作为阴性对照，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光 定量PCR，检测其灵敏度；
[0016] (8)荧光定量PCR重复性的检测:将Teasy-PCVl-2-P重组质粒稀释至104拷贝数/μL 进行8次重复，用步骤(4)优化后的反应条件和体系进行TaqMan实时荧光定量PCR，间隔1个 月后再将重组质粒稀释至1〇 4拷贝数AU重复一次试验，计算2次试验Ct值的变异系数。
[0017] 其中，步骤⑴中所述上下游引物P1、P2和探针序列：
[0018] PI：57-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-37
[0019] P2：57-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-37
[0020]探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTITTATAGGATGACG-TAMRA
[0021] 该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段。
[0022] 步骤(4)中通过调整探针浓度、引物浓度及循环条件对反应的扩增效率进行优化， 具体过程为：以1〇8个拷贝AU步骤(3)获得的标准品为模板，将探针和引物分别配制成30、 20、15、10、5μπι 〇1/1，采用矩阵法筛选最佳探针和引物浓度。为了获得较稳定和较高的扩增 效率，对TaqMan实时荧光定量PCR进行双温循环和三温循环筛选，同时将退火温度从53 °C递 增到60°C，对退火温度进行筛选。
[0023] 有益效果：
[0024]本发明利用设计的针对PCV1 -2的引物，可特异地扩增PCV1 -2的基因序列，仅仅进 行一个qPCR反应便可检测样本中的PCV1-2及其拷贝数，可节省传统测序鉴定方法所需的大 量时间和费用。同时，我们使用的6-FAM作为探针荧光染料，与CAL Fluor Orange 560荧光 染料相比其价格低廉，合成价格不足千元，并可为常规实验室现有荧光定量PCR仪支持。所 以，该方法的建立可对PCV1-2的进行快速高效的定量，节省大量时间和费用，且不受特定荧 光定量PCR仪的限制，应用性极强，为PCV1-2提供了可靠的定量方法。
【附图说明】
[0025] 图1是重组Teasy-PCVl-2-P质粒PCR扩增鉴定图。
[0026] 图2是TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线。
[0027] 图3是TaqMan荧光定量PCR检测方法的扩增曲线。
[0028] 图4是TaqMan荧光定量PCR检测方法的特异性。
[0029] 图5是TaqMan荧光定量PCR检测方法的敏感性。
【具体实施方式】
[0030] 本发明的具体技术方案如下：
[0031] (1)引物的设计
[0032] 根据PCV1-2基因序列，设计上下游引物P1、P2和探针序列：
[0033] PI：57-GGCGTTCTGACTGTGGTTTT-37
[0034] P2：57-TTTCTTGCTTGGCATTTTCA-37
[0035] 探针序列：6FAM-CGCACTTCTTTCACTITTATAGGATGACG-TAMRA
[0036] 该对引物能扩增出PCV1-2基因组中大小为291bp的DNA片段。
[0037] (2)PCV1_2 病毒 DNA 的提取
[0038]取培养离心后的细胞培养液上清或反复冻融后的组织研磨液上清100μΙ于1.5ml 指形管中，依次加入400μ1超纯水、92μ1 10%SDS溶液和8μ1蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀后 置55°C金属浴30min。再加入体积比为1:1的苯酸:氯仿600μ1，剧烈震荡混勾，12000r/min离 心15min，吸取上清400μ1，加入-20°C预冷的无水乙醇800μ1，反复颠倒数次，-20°C静置 10111；[11以上，120001'/111；[11离心9111；[11。弃上清，加入70%乙醇80(^1洗涤，120001'/111；[11离心5111；[11， 弃上清，瞬离，吸取残液并晾干，加入30μ1 RTE，37°C作用30min，立刻使用或-20°C保存备 用。
[0039] (3)构建重组质粒 Teasy-PCVl-2-P
[0040] ①病毒DNA的扩增
[00411在PCR管中分别加入下列试剂，建立25μ1的扩增反应体系:灭菌超纯水17.25μ1，10 XReaction buffer(Mg2+Free)2·5μ1，MgCl2(25mmol/l)1·5μ1，dNTPs(lOmmol/μΙ)0·5μ1， 上下游引物P1、P2 (20μπιο 1 /μ 1)各0 · 5μ 1，DNA模板2μ 1，Taq DNA聚合酶0 · 25μ 1。
[0042] PCR扩增参数:94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共35个 循环;72°C延伸lOmin，4°C保存。将扩增的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结 果如图 1 所不（M:200bp DNA ladder; 1-2:PCR product of sample;3:Negative control)。
[0043] ②DNA片段的纯化回收
[0044] PCR产物电泳鉴定正确后，切下目的条带于1.5ml指形管中，用Agarose gel DNA extraction kit(Axygen公司产品）按产品说明书回收目的片段，最后用15μ1超纯水或缓冲 液洗脱并测定核酸浓度，_20°C保存。
[0045] ③回收产物连接