一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种新型隐球菌荚膜多糖 (Glucuronoxylomannan，GXM)抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 新型隐球菌(Crytococcus Neoformans)是一种重要的条件致病菌，常感染免疫能 力低下或免疫能力缺陷的患者，导致以中枢神经系统感染为主的深部真菌感染，病死率很 高。美国疾病预防与控制中心(CDC)于1992-1993年进行的大系列流行病学研究显示，深部 真菌感染的年发病率为178.3/百万。其中，隐球菌病为65.5/百万，约占36.7%。
[0003] 近年来由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素、肿瘤化疗、放疗和器官移植后免疫抑 制剂的长期广泛应用，以及艾滋病的流行，隐球菌病明显增多。新型隐球菌性脑膜炎（以下 简称"隐脑"）就是由新型隐球菌所致的最常见的中枢神经系统疾病，占隐球菌病的80%左 右。隐脑的临床表现复杂，症状不典型，因而很难诊断，约80%的隐脑患者会被误诊为结核 性脑膜炎。
[0004] 新型隐球菌荚膜多糖(Glucuronoxylomannan，GXM)是引起病理变化的主要毒性因 子。在菌体生长和繁殖过程中，GXM被不断分泌到胞外，通过免疫抑制作用和免疫调理作用 从而影响宿主的免疫系统。国外实验室已开展了检测血液和脑脊液中GXM的研究，使隐脑的 早期诊断率得以提高。
[0005] 目前国际上开展的GXM的检测方法主要有以下3大类：
[0006] 1)印度墨汁染色法:该法敏感性差，阳性检出率很低，局限性大；
[0007] 2)血培养或脑脊液培养等培养的方法:该法敏感性差，阳性检出率不高；
[0008] 3)免疫学检测法:用特异性针对GXM的抗体实现对新型隐球菌的检测，检测血液和 脑脊液的敏感性都能达到85%以上。
[0009] 免疫学检测方法的灵敏度和特异性都较前两种方法有明显的优势，正逐渐成为新 型隐球菌检测的常用方法。
[0010] 免疫检测技术是利用抗原抗体间能特异性结合反应，通过检测标记在反应物上的 标记物，对抗原或抗体实现定性或定量检测的方法。根据标记物质的不同，分为酶联免疫分 析技术(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay，ELISA)、免疫焚光检测技术、化学发光免疫 分析技术、免疫微球技术、免疫胶体金技术等。其中ELI SA技术具有操作简单、灵敏度高、检 测时间短的特点，在临床检测和科学研究中被广泛使用。
[0011] 在新型隐球菌的临床检测中，目前国际市场上有为数不多的免疫检测产品，如： IMMY公司的乳胶凝集法产品和胶体金法产品，Bio-Rad公司的乳胶凝集法产品，Meridian公 司的乳胶凝集法和ELISA法检测试剂盒产品。Meridian公司的ELISA试剂盒采用双抗夹心 法，其方法是先将隐球菌的特异多克隆抗体包被在酶标板上，再加入待检样本与多克隆抗 体反应，37°C反应10min，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体，37°C反应10min， 待检样本中的抗原会与特异单克隆抗体结合并形成夹心结构，再加入显色底物显色，颜色 的深浅和待检抗原的浓度呈正相关，从而实现GXM的检测。我国国内并没有真正用于新型隐 球菌临床检测的免疫学检测产品。因此，在新型隐球菌临床检测领域内，迫切需要一种国内 自主研发的定量检测GXM的诊断试剂盒产品。
【发明内容】
[0012] 本发明一个目的在于提供一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒，所述 GXM免疫检测试剂盒包括:GXM包被的酶标载体、抗GXM多克隆酶标抗体、GXM标准品。
[0013] 所述的GXM是从新型隐球菌培养液中提取纯化得到的，所述的提取为将酸化后的 新型隐球菌培养液加入乙醇沉淀得到GXM粗提物，所述的纯化方法为亲和免疫层析法。
[0014] 所述的GXM的提取，包括如下步骤：
[0015] (1)培养新型隐球菌，至菌浓度达到对数期后期；
[0016] (2)将菌液高压灭菌，离心除去菌体，保留上清液；
[0017] (3)向上清液中边搅拌边缓慢加入醋酸钙粉末，然后加冰醋酸调pH至酸性；
[0018] (4)向步骤(3)得到的溶液中加入乙醇，4°C静置过夜，离心，弃去上清，干燥沉淀， 得到GXM粗提物。
[0019] 所述的GXM的纯化是通过使用新型隐球菌荚膜多糖GXM免疫亲和层析柱进行的，包 括如下步骤：
[0020] (1)用20倍柱床体积与待纯化抗原溶液相同的缓冲液洗柱；
[0021] (2)将待纯化抗原溶液加入层析柱，按每毫升柱体积0.5-1.5mL/h的流速，使抗原 溶液流过层析柱；
[0022] (3)用10-25倍柱床体积的结合缓冲液洗柱；
[0023] (4)用10-25倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱；
[0024] (5)连续以0.4-0.8倍柱床体积的洗脱缓冲液通过层析柱，分管收集GXM洗脱液。
[0025]优选的，步骤⑶中所述的结合缓冲液选自pH6.0-8.0的PBS缓冲液、pH6.0-8.0的 Tris-HCl缓冲液、pH6.0-8.0醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种，优选pH6.0-8.0的PBS缓冲液； [0026]优选的，步骤(4)中所述的预洗脱缓冲液为 PH8.5-9.5碳酸盐缓冲液；
[0027]优选的，步骤(5)中所述的洗脱缓冲液为pH3.0的缓冲液，优选pH3.0的0.1M甘氨酸 缓冲液、PH3.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液、pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、pH3.0的醋酸-醋 酸钠缓冲液；
[0028]优选的，步骤(5)中所述的GXM洗脱液进行透析去盐处理或用缓冲液调节其pH值。 [0029] 所述的GXM标准品由一系列不同浓度的GXM溶液组成，所述的GXM溶液是将GXM溶于 合适的溶剂中形成具有特定浓度的GXM的溶液。
[0030]所述的抗GXM多克隆抗体，是由下述方法制备得到的：用GXM作为免疫原免疫动物 得到的血清进行分离纯化，得到抗体;所述纯化方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层 析法，所述免疫方法可以为皮下注射、脾内注射、静脉注射或腹腔注射，免疫剂量为0.01-lmg/只，免疫的动物为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、马、猪或驴，优选兔。
[0031 ]上述抗GXM多克隆抗体的制备方法，具体步骤为：
[0032] (1)用GXM抗原免疫动物；
[0033] (2)测定免疫后动物的血清效价，从免疫后的动物体内取血；
[0034] (3)用饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层析法进行初步纯化。
[0035]由上述步骤制备得到的抗GXM多克隆抗体可与GXM特异性结合，用SDS-PAGE显示为 均一抗体产物，间接法ELISA检测显示其效价大于1:1 X 106。
[0036] 所述的GXM包被的酶标载体，由以下方法制备得到：
[0037] ①用包被缓冲液稀释GXM得到GXM包被液，加入酶标板孔中进行包被；
[0038]②向步骤①得到的酶标板孔中加入封闭液进行封闭；
[0039] ③将步骤②得到的酶标板弃去封闭液，孵育，得到GXM包被的酶标载体。
[0040] 优选的，所述的酶标载体为微孔板、塑料管;更优选的，所述的酶标载体为微孔板；
[0041] 优选的，所述的用于标记的酶为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP);更优选 的，所述的用于标记的酶为辣根过氧化物酶；
[0042] 优选的，所述的GXM标准品至少有0-100ng/mL范围内的3种不同浓度；
[0043]在本发明的一个【具体实施方式】中，上述新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒 中，所述GXM标准品有5种不同浓度，分别记为a、b、c、d和e，其浓度分别为100、32、10、6.4、 3·2ng/mL〇
[0044] 优选的，上述新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒，还包括样本处理液、浓缩 洗液、样本稀释液、底物溶液和终止液；
[0045] 优选的，所述的浓缩洗液、样本稀释液、样本处理液、底物溶液和终止液的组分及 配比如下：
[0046] 浓缩洗液:含0.4-1.0 %吐温的磷酸盐缓冲液；
[0047]样本稀释液:人工脑脊液或人工血清；
[0048] 样本处理液选自以下溶液：pH2.0-10.0的蛋白变性溶液；pH4.0-4.8的0 . Οδ-Ο · 2mol/L 的 EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 溶液; pH2 · 2-2 · 8的0 · 07-0 · 2mol/L 的甘氨酸-HCL(甘 氨酸-盐酸）溶液;PH8 · 0-9 · 0的0 · 05-15mg/mL的链酶蛋白酶;pH8 · 5-1 · 0的0 · 01-0 · lmol/L的 SDS(十二烷基磺酸钠)溶液或pH7.2-8.0的l-8mol/L的尿素；
[0049] 底物溶液:TMB(四甲基联苯胺）、0PD(邻苯二胺）、0T(邻联甲苯胺）、六8了3(2,2'-连 氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））或ρ-ΝΡΡ(对硝基苯磷酸酯）；优选ΤΜΒ;
[0050] 终止液：1 -20mo 1 /L的硫酸溶液，优选2mo 1 /L的硫酸溶液。
[0051] 在本发明的一个【具体实施方式】中，所述的浓缩洗液的组分及配比为:按重量份数 计，氯化钠96.0份，氯化钾2.40份，十二水合磷酸氢二钠42.96份，磷酸二氢钾2.88份，吐温-20 0.05份，超纯水1000份。
[0052] 本发明的另一个目的是提供一种新型隐球菌荚膜多糖抗原免疫检测试剂盒的制 备方法，其具体步骤如下：
[0053] (1)制备酶标载体
[0054] ①用包被缓冲液稀释GXM，得到GXM包被液，加入酶标板孔中进行包被；
[0055] ②向步骤①得到的酶标板孔中加入封闭液进行封闭；
[0056] ③将步骤②得到的酶标板弃去封闭液，孵育，得到GXM包被的酶标载体。
[0057] (2)GXM标准品的制备
[0058] 稀释GXM抗原，制备GXM标准品；
[0059] (3)抗GXM多克隆酶标抗体溶液的配制：
[0060] 用于标记的酶为辣根过氧化物酶，采用过碘酸盐氧化法进行抗GXM多克隆酶标抗 体的制备;或用于标记的酶为碱性磷酸酶，采用戊二醛交联法进行抗GXM多克隆酶标记抗体 的制备；
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