结直肠癌预后判断标记物、表达评估方法、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌预后判断标记物、该标记物在 制备试剂盒中的应用、该标记物的表达评估方法、包含该标记物的试剂盒及该试剂盒在用 于结直肠癌预后判断标记物表达水平检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌包括结肠癌和直肠癌，是全世界范围内常见的恶性肿瘤，其病死率位居 全球恶性肿瘤死因的第二位，进展期结直肠癌预后较差。根据国际癌症研究组织2005年 公布的数据显示，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势，其中大多数为结肠癌。我国结肠癌 的标准发病率为13. 29/10万，发病率呈明显上升趋势。结直肠癌的发生与饮食、环境、遗传 等密切相关，是多因素协同作用的结果。结直肠癌的防治研究引起人们的高度重视，生物 标志物的发现与检测，对预测结肠癌的发生、发展、治疗效果及预后判断有一定的临床指 导意义。
[0003] TNM分期目前是判断结直肠癌患者预后的最重要的临床预测指标。然而，许多患者 即使??Μ分期属于早期，肿瘤仍有可能复发。因此需要研究更好的用于风险评估的预后标 志物。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种结直肠癌预后判断标记物 SLC12A5,其高水平的表达与患者的预后较差成正相关。
[0005] 本发明另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种结直肠癌预后判断标记 物在制备试剂盒中的应用，该试剂盒可以用于结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水 平检测。
[0006] 本发明又一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种结直肠癌预后判断标记 物的表达评估方法，可以评估结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水平。
[0007] 本发明再一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种试剂盒，可用于检测结 直肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水平。
[0008] 本发明的还一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种试剂盒在用于结直肠 癌预后判断标记物SLC12A5表达水平检测中的应用，通过应用该试剂盒可方便地检测结直 肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水平。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
[0010] -种结直肠癌预后判断标记物，所述结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的氨基酸 序列如SEQ N0 :1所示。
[0011] -种结直肠癌预后判断标记物在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒用于氨基酸序 列如SEQ N0 :1所示的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5表达水平的检测。
[0012] -种结直肠癌预后判断标记物的表达评估方法，包括：
[0013] 获取待测标本；
[0014] 将包埋所述待测标本的蜡块切成切片；
[0015] 对所述切片进行免疫组化检测；
[0016] 根据氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的阳性细 胞染色的百分比评估结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水平。
[0017] -种试剂盒，用于结直肠癌预后判断标记物的表达水平检测，包括一抗，所述一抗 为氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的抗体。
[0018] 以及，一种上述试剂盒在用于结直肠癌预后判断标记物表达水平检测中的应用。
[0019] 本发明提供的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5,在结直肠癌发生发展中起着重 要的促进作用，SLC12A5在正常肠粘膜组织中表达沉默，但是在结直肠癌中的表达水平高低 不一，大样本的临床资料分析发现SLC12A5的高水平的表达与患者的预后较差成正相关， 提示SLC12A5有望成为重要的结直肠癌患者预后的生物标记物。
[0020] 采用本发明的结直肠癌预后判断标记物，可以制备用于氨基酸序列如SEQ N0 :1 所示的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5的表达水平检测的试剂盒。
[0021] 本发明提供的结直肠癌预后判断标记物的表达评估方法，可以检测结直肠癌预后 判断标记物的表达水平，有助于判断结直肠癌患者的预后情况。
[0022] 本发明提供的试剂盒，可方便地检测结直肠癌预后判断标记物的表达水平
[0023] 采用本发明提供的试剂盒，可方便检测结直肠癌预后判断标记物的表达水平。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1的SLC12A5在结直肠癌及正常肠粘膜中的表达水平结果；
[0025] 图2为本发明实施例1中SLC12A5在成对的结直肠癌和癌旁组织中的相对表达量 结果；
[0026] 图3为本发明实施例1中SLC12A5在结直肠癌中的低表达和高表达的示意图；
[0027] 图4为本发明实施例2中裸鼠的肿瘤生长曲线图；
[0028] 图5为本发明实施例2中裸鼠的肿瘤重量的直方图；
[0029] 图6为本发明实施例3中SLC12A5不同表达水平对结直肠癌患者预后判断的 Kaplan-Meier分析曲线图。
【具体实施方式】
[0030] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0031] 本发明提供了一种结直肠癌预后判断标记物。该结直肠癌预后判断标记物 SLC12A5的氨基酸序列如SEQ N0 :1所示。
[0032] 该结直肠癌预后判断标记物SLC12A5由全基因组测序及大样本结直肠癌研究发 现，在结直肠癌发生发展中起着重要的促进作用，SLC12A5在正常肠粘膜组织中表达沉默， 但是在结直肠癌中的表达水平高低不一，大样本的临床资料分析发现SLC12A5的高水平的 表达与患者的预后较差成正相关，提示SLC12A5有望成为重要的结直肠癌患者预后的生物 标记物。
[0033] 下述实施例1表征了该结直肠癌预后判断标记物SLC12A5在正常组织和结直肠 癌中的表达水平。该实施例验证了 SLC12A5在正常肠粘膜组织中表达沉默，但是在结直肠 癌中的表达水平高低不一，从而可以作为结直肠癌预后判断标记物。实施例2表征了敲低 SLC12A5的表达对裸鼠肿瘤生长影响，从而论证了该SLC12A5在结直肠癌发生发展中起着 重要的促进作用，表明其可以作为结直肠癌预后判断标记物。
[0034] 实施例1SLC12A5在结直肠癌表达上调试验
[0035] 分别在结直肠癌及正常肠粘膜中应用本发明实施例的免疫组化方法检测SLC12A5 的表达水平，发现SLC12A5在正常肠粘膜中表达沉默，而在结直肠癌中表达上调。其结果如 图1所示，图1为本发明实施例1的SLC12A5在结直肠癌及正常肠粘膜中的表达水平结果。 其中，图（a)表示结直肠癌组织（CRC tumor tissues)，图（b)表示癌旁正常组织（Adjacent normal tissues)〇
[0036] 基于SLC12A5在结直肠癌的上调现象，选取15对结直肠癌组织样本，并利用免疫 组化分析其SLC12A5的表达情况。结果如图2所示，图2为本发明实施例1中SLC12A5在 成对的结直肠癌和癌旁组织中的相对表达量结果，其中T表示结直肠癌组织，AN表示癌旁 组织。从图2可以看出，SLC12A5在结直肠癌的表达量显著高于癌旁组织中的表达量。根 据本发明实施例的结直肠癌预后判断标记物的表达评估方法的评分标准评估结直肠癌标 记物的表达水平，其结果如图3所示。图3为本发明实施例1中SLC12A5在结直肠癌中的 低表达和尚表达的不意图，其中，图（a)表不低表达，图（b)表不尚表达。
[0037] 实施例2敲低SLC12A5的表达对裸鼠肿瘤生长影响的体内试验
[0038] 随机将对照细胞株HCT116/control或HCT116/shSLC12A5注入到裸鼠的背侧，并 对肿瘤的生长模式进行了比较。肿瘤体积每3天测量一次，持续大约三个星期。通过测量最 长和最短的肿瘤直径长度（体积公式=0. 5X长X2X宽）计算肿瘤体积（mm3)。接种后 22天，实验终止，老鼠被处死。裸鼠的肿瘤生长曲线如图4所示，其中，C表示注入HCT116/ control的肿瘤生长曲线，S表示注入HCT116/shSLC12A5的肿瘤生长曲线。注射HCT116/ shSLC12A5裸鼠的平均肿瘤大小显著低于注射HCT116/control的对照组裸鼠（P〈0. 001， 方差分析，η = 5/组）。将肿瘤分离，测量重量。如图5所示，直方图分别表示HCT116/ shSLC12A5和HCT116/control两组的肿瘤重量（Ρ值小于0.05, t检验），其中，C表示注 入HCT116/control的肿瘤重量，S表示注入HCT116/shSLC12A5的肿瘤重量。从HCT116/ shSLC12A5组分离下的肿瘤组织比对照组轻（P〈0. 05)。
[0039] 针对该SLC12A5可以作为结直肠癌预后判断标记物的特性，本发明还提供了该结 直肠癌预后判断标记物SLC12A5在制备试剂盒中的应用，该试剂盒用于氨基酸序列如SEQ N0 :1所示的结直肠癌预后判断标记物SLC12A5表达水平的检测。
[0040] 针对该SLC12A5可以作为结直肠癌预后判断标记物的特性，本发明还提供了一种 结直肠癌预后判断标记物的表达评估方法，可以通过该方法评估结直肠癌预后判断标记物 的表达水平，从而判断结直肠癌患者的预后情况。该方法包括如下的步骤：
[0041] 步骤S10 :获取待测标本。
[0042] 待测标本可以是结直肠癌新鲜样本或者蜡块标本。
[0043] 步骤S20 :将包埋待测标本的蜡块切成切片。
[0044] 该步骤的目的是包埋肿瘤