经工程改造以利用非常规的磷或硫源的微生物的制作方法
【专利说明】经工程改造以利用非常规的磷或硫源的微生物
[0001]相关申请 本申请要求于2013年8月27日提交的美国临时专利申请系列号61/870,469的优先权， 其通过引用结合到本文中。
[0002] 背景 在发酵工业中，通常配制细胞培养基以提供宿主细胞系生长所必需的全部营养素，且 特别强调满足细胞系对碳、氮、磷、硫和其它主要营养素的需求。一些细胞系需要另外的成 分，包括氨基酸、微量矿物质和金属，和复杂的生长因子。这些营养素的存在为选择的生物 体(不幸的是，也为任何潜在的污染生物体)提供合适的生长环境。在这种环境下，生产生物 体需要直接与细胞培养中的任何污染生物体竞争。
[0003] 即使在强壮的宿主中，培养物的机会性感染和产品制备需求造成的代谢负担的组 合是单一培养操作中的主要关注。工业稳健性(robustness)通常被认为是一种对宿主菌株 有特异性的多基因特性，因此难以在发育过程的后期可预见地经工程改造到生物体内。加 入选择性生长抑制剂，例如细菌抗生素，是一种用来创立对生长抑制剂抵抗的宿主生物体 的较稳健的发酵环境的方法。然而，抗生素的添加往往是不可取的或不可行的，且频繁地导 致自发抗性污染。
[0004] 因此，存在对合理工程改造特性的需求，所述工程改造特性当经工程改造进入宿 主生物体内时，仓il立一种稳健的单一培养发酵环境。
[0005] 发明简述 在某些实施方案中，本发明涉及基因工程改造的生物体，其中基因工程改造的生物体 已由包含本文公开的任一序列的核酸分子转化。
[0006] 在某些实施方案中，本发明涉及基因工程改造的生物体，其中基因工程改造的生 物体已被核酸分子转化;所述核酸分子包含非天然基因；和所述非天然基因编码选自以下 的非天然酶:NAD:亚磷酸氧化还原酶(亚磷酸脱氢酶）、甘油-3-磷酸脱氢酶（sn-甘油3-磷 酸：NAD( + )氧化还原酶，EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、有机磷酸降解酶、磷酸二酯 酶、磷脂酶、脱硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物单加氧酶、2-羟基联苯-2-亚磺酸亚磺酰基 水解酶、二苯并噻吩单加氧酶和NADH-FMN氧化还原酶。
[0007] 在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括以下步骤 使任一种前述基因工程改造的生物体与底物接触， 其中 底物包含含磷部分和非-含磷部分； 含磷部分包含约10%重量-约100%重量的量的式I-III的任一项的含磷化合物； 式I化合物是
其中，对于每次出现时独立地， R 是-Η、烷基、-OH、-OR2、-SH 或-SR2; R1是-H或烷基； Y是〇或S; Y1是〇或S;和 R2是烷基； 式II化合物是 II
其中，对于每次出现时独立地， R1是-H或烷基;和 Y1是〇或S; 式III化合物是
III 其中，对于每次出现时独立地， R3是-H、-OH、-OR4、-SH、-SR4、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基或杂芳烷基；和 R4是烷基或芳基； 与所述基因工程改造的生物体相同的物种的天然生物体不能代谢所述含磷化合物 (即，用作磷源）；和 所述基因工程改造的生物体将所述底物转化为产物。
[0008]在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括以下步骤 使任一种前述基因工程改造的生物体与底物接触， 其中 底物包含含硫部分和非-含硫部分； 含硫部分包含约10%重量-约100%重量的量的式IV-XI的任一项的含硫化合物； 式IV化合物是
IV 其中，对于每次出现时独立地， R5是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-S0 2H、-NHR7 或-NH-C(=0)-R7; R6是-Η、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-S0 2H、-NHR7 或-NH-C(=0)-R7jP R7是环烷基、烷基或芳基，或任何两个R7结合在一起，形成5-或6-元环； 式V、式VI或式VII的化合物是
V VI VII 其中，对于每次出现时独立地， R8是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-S〇2H、-NHR 7 或-NH-C(=0)-R7; R7是环烷基、烷基或芳基，或任何两个R7结合在一起，形成5-或6-元环； 式VIII、式IX或式X的化合物是
VIII IX X 其中，对于每次出现时独立地， R9是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-S〇2H、-NH2、-NHR 7 或-NH-C (=0) -R7; R7是环烷基、烷基或芳基，或任何两个R7结合在一起，形成5-或6-元环； R1()是羟基烷基、R9或-(CH2) XR9;和 X是1、2、3或4; 式XI化合物是
XI 其中，对于每次出现时独立地， R9是-H、-OH、-OR7、-SH、-SR7、R7、卤代、烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、-S0 2H、-順2、-NHR7 或-NH-C (=0) -R7;和 R7是环烷基、烷基或芳基，或任何两个R7结合在一起，形成5-或6-元环； 与所述基因工程改造的生物体相同的物种的天然生物体不能代谢所述含硫化合物 (即，用作硫源）；和 所述基因工程改造的生物体将所述底物转化为产物。
[0009] 在某些实施方案中，本发明涉及由任一种前述方法制备的产物。
[0010] 在某些实施方案中，本发明涉及一种包含可操作地连接于启动子的基因的重组载 体，其中所述基因编码酶;和所述酶是NAD:亚磷酸氧化还原酶(亚磷酸脱氢酶）、甘油-3-磷 酸脱氢酶(sn-甘油3-磷酸：NAD( + )氧化还原酶，EC 1.1.1.8)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、有 机磷酸降解酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、脱硫酶、二苯并噻吩-5,5-二氧化物单加氧酶、2-羟基 联苯-2-亚磺酸亚磺酰基水解酶、二苯并噻吩单加氧酶或NADH-FMN氧化还原酶。
[0011] 附图简述 图1描述本发明的各个DNA序列。
[0012]图2用表格列出本发明的各种生物体和示范性潜在应用。
[0013]图3用表格列出本发明的各种生物体和示范性潜在应用。
[0014]图4用表格列出可用作本发明的原料的各个有机磷化合物，以及各化合物的化学 式。
[0015] 图5用表格列出可用作本发明的原料的各个有机硫化合物，以及各化合物的化学 式。
[0016] 图6描述可用作本发明的原料的各个有机磷化合物的名称和结构。
[0017] 图7描述可用作本发明的原料的各个有机硫化合物的名称和结构。
[0018]图8描述载体pNC273的质粒图谱，其被用来构建菌株NS392。
[0019] 图9用表格列出pNC273的序列。
[0020] 图10描述两种生物体(改良的解脂耶氏酵母(Y. lipolytica) NS392 (实心圆）和 野生型酿酒酵母(S. cerevisiae) NS22 (空心圆））在3种不同的生长培养基上的生长:作 为唯一的磷源的亚磷酸钾（左），作为唯一的磷源的磷酸钾（中），和作为对照条件的磷酸钾 加潮霉素 (hygromyic)。
[0021] 图11描述NS22,野生型酿酒酵母(S. cerevisiae)在用磷酸盐或亚磷酸盐作为磷 源的限定培养基中的生长。制备接种物的不同的10-倍连续稀释液以观察可能出现的滞后 期。
[0022] 图12描述使用(a)磷酸盐(Pi)和(b)亚磷酸盐(Pt)的NS435的生长。
[0023]图13描述NS435在亚磷酸盐培养基中的连续转移后的分离株的生长。
[0024] 图14描述pNC360的质粒图谱。
[0025] 图15用表格列出pNC360的序列。
[0026]图16描述使用不同浓度的次磷酸盐的NS435的生长。
[0027]图17描述在含有磷酸盐(Pi，左）或亚磷酸盐(Pt，右)作为磷源的限定培养基琼脂 板上的NS252 + ptxD转化株菌斑。还描述了未转化的NS252菌斑。
[0028] 图18描述pNC351的质粒图谱。
[0029] 图19用表格列出pNC351的序列。
[0030] 发明详述 概观 在某些实施方案中，本发明涉及基因工程改造的宿主生物体，其中基因工程改造的宿 主生物体具有从复合底物中获得生长-限制营养素的非天然能力；和所述复合底物不能被 天然宿主生物体代谢或用作营养素。在某些实施方案中，所述非天然能力将提供具有显著 竞争优势的生物体，并为在发酵过程中的污染物的成功提供一个主要屏障。
[0031] 在某些实施方案中，生物体一般仅含有少量的磷和硫(如，分别为细胞质量的约3% 和约1%)。所以，为了生长，与例如氮比较，生物体需要更少的这些生长限制的营养素。
[0032] 在某些实施方案中，基因工程改造的宿主生物体是细菌、酵母、真菌、藻类、哺乳动 物细胞或昆虫细胞。在某些实施方案中，基因工程改造的宿主生物体是细菌或酵母。
[0033] 在某些实施方案中，本发明涉及使用上述基因工程改造的宿主生物体的方法，其 包括使基因工程改造的宿主生物体与改良的细胞培养基接触。在某些实施方案中，本发明 涉及使用上述基因工程改造的宿主生物体的方法，其包括使基因工程改造的宿主生物体与 改良的细胞培养基接触，其中基因工程改造的宿主生物体将细胞培养基转化为产物。在某 些实施方案中，使用这种途径提供一种独特而有针对性的方式，以促进所需基因工程改造 的宿主生物体的生长。在某些实施方案中，上述方法最大限度地减少污染生物体的生长，提 供有价值的竞争优势，并允许控制生产一系列有价值的产物。
[0034] 在某些实施方案中，本发明方法减少或消除在大规模酵母培养中使用预防性抗生 素的必要性。由于新出现的环境考虑和社会压力，避免不必要的抗生素是一个重要的好处。 此外，在某些实施方案中，所述技术可应用于可不加入抗生素的细菌系统。在某些实施方案 中，可应用所述技术以最大限度地减少天然抵抗许多通常使用的抗生素的野生酵母污染物 的生长。
[0035]在某些实施方案中，基因工程改造的宿主生物体是酵母;和产物是乙醇、异丁醇、 乳酸、琥珀酸、赤藻糖醇、类异戊二烯、脂质和酶产物、批量商品化学品或高价值特殊化学 品。
[0036]在某些实施方案中，基因工程改造的宿主生物体是细菌；和产物是丁醇、乙醇、异 丙醇、1，3-丙二醇(PD0)、1，4-丁二醇(BD0)、琥珀酸、衣康酸、酶产物、多元醇、蛋白产物、批 量商品化学品或高价值特殊化学品。
[0037] 在某些实施方案中，本发明的技术可应用于生产一种或多种商品、精细化学品或 药品。
[0038] 定义 如本^用的，术语"生物质"是指一种主要含有碳水化合物的物质。生物质也可指一 种含有多糖的物质。它也可指含有纤维素、半纤维素或木质纤维素的物质。生物质通常得 自，例如，木材、植物、来自农业或林业的残余物、市政和工业废物的有机组成部分、来自造 纸的原生淤浆、废纸、废木料(如，锯肩）；农业残余物例如玉米皮、玉米芯、稻壳、稻草、甘蔗 渣;得自玉米、小麦、燕麦和大麦的淀粉;来自硬木头或树皮的植物废料;纤维板工业废水、 甘蔗肩、甘蔗渣、废蜜、后发酵液、糠醛馏渣、水性橡木提取物、稻壳、燕麦残留物、木糖废液、 杉木锯肩、石脑油、玉米芯糠醛渣、棉花球、大米、稻草、大豆皮，豆油渣、玉米皮、棉花杆、棉 籽壳、淀粉、土豆、甘薯、乳糖、废木材制浆残留物、葵花籽壳、己糖、戊糖、来自甘蔗和甜菜的 蔗糖、玉米糖浆、大麻，和以上的组合。
[0039] 〃干重〃和〃干细胞重量〃意指在相对没有水的情况下测定的重量。例如，提及包含 以干重计的特定百分比的特定成分的含油细胞时，意指百分比基于基本上所有的水已被除 去后的细胞重量计算。
[0040] 〃外源基因〃是指已引入细胞（如，通过转化/转染）的编码RNA和/或蛋白的表达的 核酸，并且也称为〃转基因〃。包含外源基因的细胞可称为重组细胞，另外的外源基因可引入 其中。相对于要转化的细胞，外源基因可来自不同的物种（因此为异源的），或来自相同物种 (因此为同源的）。因此、外源基因可包括相对于基因的内源性拷贝，占据细胞的基因组中不 同的位置或在不同的控制下的同源基因。外源基因可以一个以上的拷贝存在于细胞中。外 源基因可作为基因组(核或质体)的插入物或作为游离基因分子维持在细胞中。
[0041] 〃表达载体〃或〃表达构建体〃或〃质粒〃或〃重组DNA构建体〃是用于将核酸引入宿主 细胞的媒介。核酸可以是经由人干预(包括通过重组手段或直接化学合成），用一系列允许 转录和/或翻译特定核酸的指定核酸元件生成的核酸。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片 段的部分，或其它合适的媒介。典型地，表达载体包括可操作地连接于启动子的待转录的核 酸。
[0042] "诱导型启动子"是响应于特定的刺激，介导可操作地连接的基因的转录的启动 子。
[0043] "可操作地连接"是两个核酸序列之间的功能连接，例如控制序列（典型地，启动 子)和连接的序列（典型地，编码蛋白的序列，也称为编码序列）。如果启动子可介导外源基 因的转录，启动子与所述基因可操作地连接。
[0044] 〃溶胞产物"是一种包含溶解的细胞内容物的溶液。
[0045] 〃溶解〃是指胞浆膜和任选生物有机体的细胞壁的破裂，其足以释放至少一些细胞 内容物，通常通过损害其完整性的机械、病毒或渗透机制进行。
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