高活性纤维二糖水解酶的制备方法及高活性纤维二糖水解酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物炼制化iorefinery)的糖化酶。特别是设及提高了活性的纤维二 糖水解酶的制备方法W及具有高活性的纤维二糖水解酶。
【背景技术】
[0002] 通过基因重组技术，能够进行各种各样的蛋白质改性。针对酶也进行了提高活性、 增加表达量等增强酶活性的尝试。采取如下手法作为提高酶活性的手法：改变氨基酸，向酶 与底物结合的活性中屯、的氨基酸导入变异，从中选择高活性的酶。
[0003] 酶的底物结合部位在大多数情况下被比作钥匙-锁状。另一方面，人们已知在对 纤维素等高分子底物起作用的酶当中，虽然仅限于极少部分的酶，但它们为具有高分子底 物嵌入的隧道状或沟状的相对较长的底物结合部位的酶。
[0004] 从端部切断纤维素链的酶、即外切葡聚糖酶的反应产物是纤维二糖，也被称为纤 维二糖水解酶。纤维二糖水解酶的活性中屯、形成如上所述的隧道状，通过酶反应而被切断 的纤维二糖从隧道的相反一侧出来，因此，酶反应持续进行，而纤维二糖水解酶不会从纤维 素链脱离。
[0005] 至今为止一直在进行提高纤维二糖水解酶的酶活性的尝试，并已经报道了几种变 异体。例如，篮状菌灯alaromyces)相关的变异体（参照美国专利第8790894号说明书）、 来源于革菌（Phanerochaete)的纤维二糖水解酶的变异体相关的变异体（参照日本专利公 开公报特开2010-046034号公报）等。
【发明内容】
[0006] 然而，在生物炼制领域中需要一种更高效的酶，而在现有技术中活性提高的效果 并不充分。因此，有必要制备一种活性更高的纤维二糖水解酶变异体。
[0007] 更进一步，像纤维二糖水解酶那样，在保持高分子底物的同时进行催化反应的进 行性酶（processive enzyme)在大范围上存在的部位构成底物结合部位，因此，还大量存在 其效果没有得到研究的氨基酸。因此，本发明的课题在于对未被研究的氨基酸部位的置换 效果进行调查，获取一种具备较高活性的纤维二糖水解酶。
[0008] 本发明的制备提高了活性的纤维二糖水解酶的方法的特征在于：将作为从序列号 1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在与所述纤维二糖水 解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天口冬酷置换为丙 氨酸。
[0009] 使用作为确定影响蛋白质功能的部位的一方法的丙氨酸扫描 (Alanine-scanning)进行解析后发现：通过将作为由序列号1所示的纤维二糖水解酶的第 62位氨基酸的天口冬酷胺置换为丙氨酸，能够获得一种具备高活性的纤维二糖水解酶。该 氨基酸残基位于纤维二糖水解酶的隧道结构内。
[0010] 因此，可W推测只要是与由序列号1所示的纤维二糖水解酶具有同源性的纤维二 糖水解酶，通过将与该位置对应的位置的天口冬酷胺置换为丙氨酸，同样能够获得高活性 的纤维二糖水解酶。
[0011] 另外，本发明的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于具备下述变异：将作为 从序列号1所示纤维二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在与所述纤 维二糖水解酶具有同源性的纤维二糖水解酶的氨基酸序列中的对应于该位置的天口冬酷 置换为丙氨酸。
[0012] 将序列号1所示的序列的第62位的天口冬酷胺置换为丙氨酸后的纤维二糖水解 酶具有高活性。因此，通过将第62位的天口冬酷胺或者对应于该位置的天口冬酷胺置换为 丙氨酸后的变异体、或者除了包括该置换还进一步组合已知酶活性增强的氨基酸置换，能 够获得活性更高的纤维二糖水解酶。
[0013] 本发明的提高了活性的纤维二糖水解酶的特征在于，其序列由序列号2所示。由 序列号2所示的纤维二糖水解酶与野生型酶相比具有12倍的比活。
【附图说明】
[0014] 图1为示意性地表示纤维二糖水解酶的立体结构W及表示各氨基酸残基（amino acid residue)位置的图。
[0015] 图2为表示利用丙氨酸扫描（alanine scanning)获得的纤维二糖水解酶变异体 相对野生型的相对活性比的图。
[0016] 图3为表示通过置换了从N末端起第62位的氨基酸后相对野生型的相对活性比 的图。
【具体实施方式】
[0017] 人们已知纤维二糖水解酶的晶体结构。纤维二糖水解酶与作为底物的纤维素相互 作用的部位受长环（loop)包围，因而被称为隧道结构。与纤维素结合并发生分解反应的活 性中屯、位于隧道结构内部。所W，可W认为通过获得隧道结构内的氨基酸具有变异的酶，就 能够获得高活性变异体。
[0018] 然而，由于隧道结构跨越了大范围，要对与底物结合并影响活性的氨基酸都进行 解析是比较困难的。因此，基于立体结构，选择预测存在于隧道结构内、并且对相对作为 底物的纤维素的移动构成障碍从而影响活性的可能性较高的氨基酸，通过丙氨酸扫描进 行解析。首先，为了导入变异，分离纤维二糖水解酶基因，构建通过米曲霉（Aspergillus cxryzae)表达的载体。
[0019] (1)构建通过米曲霉表达纤维二糖水解酶的载体（vector)(提取纤维顶抱霉 (Acremonium cellulolyticus)的基因组DNA)将纤维顶抱霉的H1 菌株（阳RM BP-11508, W 下简称"化菌株"）接种到PDB琼脂培养基（在PDA培养基度D Difco公司制，PDA broth) 中添加了 1.5% (质量/体积）的琼脂糖（agarose)的平板培养基）上，在30°C下培养一 周。将得到的菌体W每个琼脂直径5mm为单位进行切取，并接种于PDA培养基中，W 30°C 下、130巧m进行摇瓶培养（shaking culUire)。W 15000巧m对培养物进行10分钟离屯、分 离处理，由此回收菌体。更进一步，通过PDA培养基重复清洗回收的菌体两次，从而获取菌 体试样。
[0020] 在装入有该菌体的2mL容量的塑料试管中加入研磨珠，利用台式珠磨粉碎机 (Shake master,生物科学社制）实施90秒的粉碎处理Ξ次，将菌体试样磨成粉末状后，使 用 Nucleon (Amersham 公司制）提取 DNA。
[0021] (纤维顶抱霉的野生型纤维二糖水解酶的DNA克隆）
[0022] 将获得的基因组作为模板，使用序列号3、4(参照下述表1)所示的引物 (primer) 1、2,通过PCR扩增编码野生型的纤维二糖水解酶的序列。使用K0D-plus(东洋纺 公司制备）作为DNA聚合酶值NA polymerase)，PCR通过W下方式进行，W 94°C、2分钟进 行1个循环后，W 96°C、20秒，接着60°C、30秒，进一步72°C、5分钟进行30个循环。得到 的 PCR 产物利用 QIA 快速 PCR 产物纯化试剂盒（QIAquick PCR purification kit, QIAGEN 公司制备）进行提纯。得到的纤维顶抱霉的野生型纤维二糖水解酶的氨基酸序列示于序列 号1。
[0023] (地R-enoAP-agdAT-niaD 的制备）
[0024] 在作为大肠杆菌质粒化col i plasmid)的地R322中整合来源于米曲霉 Aspergillus oryzae的硝酸还原酶基因 niaD、来源于米曲霉的agdA基因的终止区 (terminator region) W及来源于米曲霉的enoA基因的启动区（promoter region),制成 载体地R-enoAP-agdAT-niaD。通过表达硝酸还原酶基因 niaD，能够选择导入了使得即使在 硝酸存在的情况下米曲霉也能够增殖的质粒（plasmid)的菌。W下简述制备方法。
[00巧]首先，构建整合了来源于米曲霉Aspergillus oryzae的硝酸还原酶基因 niaD基 因的质粒。通过独立行政法人制品评价技术基盘机构（N口巧获取米曲霉Aspergillus oryzae RIB40菌株（NBRC号：100959, W下称为"RIB40菌株"）。W RIB40菌株的基因组 DNA为模板，使用序列号5、6所示的引物3、4,通过PCR对硝酸还原酶基因 niaD的DNA进行 扩增。
[0026] 通过Aval及Ndel对扩增后的niaD的DNA进行消化，提纯后，将其插入到地R322 的Aval、Ndel位点，构建地R-niaD。
[0027] 接着，来源于米曲霉的agdA基因的终止区整合到地R-niaD中。
[002引 W RIB40菌株的基因组DNA为模板，使用序列号7、8所示的引物5、6,通过PCR对 来源于米曲霉的agdA基因的终止区下有时还称为"agdA终止子"）的DNA进行扩增。
[0029] 使用限制酶Sail及Aval消化得到的PCR扩增产物，并将其插入到地R-niaD的 Sail、Aval 位点，得到地R-agdAT-niaD 质粒。
[0030] 接着，将来源于米曲霉的enoA基因的启动区整合到所得到的地R-agdAT-niaD中。
[0031] W RIB40菌株的基因组DNA为模板，使用序列号9、10所示的引物7、8，进行PCR，对 来源于米曲霉的enoA基因的启动区（W下有时还称为"enoA启动子"）的DNA进行扩增。 [003引使用限制酶化el及Sail消化得到的PCR扩增产物，并将其插入到 地R-agdAT-niaD 的 Miel、Sail 位点，得到地R-enoAP-agdAT-agdAT-niaD 质粒。
[0033] [表 1]
[0034]
[0036] (野生型纤维二糖水解酶DM向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0037] 使用限制酶 Smal 消化地R-enoAP-agdAT-niaD，获得地R-enoAP-agdAT-niaD 的 Smal处理片段。
[0038] 使用In-Fusion(注册商标）皿克隆试剂盒（Clontech公司制）将编码野生型纤 维二糖水解酶的序列克隆到该Smal处理片段上，获得地R-enoAP-CBH-agdAT-niaD(CBH米 曲霉表达用载体）
[0039] (变异型纤维二糖水解酶DNA向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0040] 对于变异型纤维二糖水解酶，通过PCR制备纤维二糖水解酶基因的从5' -侧到变 异位点W及从变异位点到基因3' -侧的两个片段。通过将所得到的两个片段的DNA整合 到地R-enoAP-agdAT-niaD中来进行构建。此时，由于包含变异位点的引物被设计成能够进 行退火（annealing)，变异型纤维二糖水解酶基因除了在整合到地R-enoAP-agdAT-niaD中 时包含变异位点之外，具有从5' -侧到3' -侧与野生型纤维二糖水解酶相同的氨基酸序 列，并处于相连状态。
[00川 实施例
[004引（实施例1)
[0043] (丙氨酸置换变异体的制作）
[0044] W纤维顶抱霉的纤维二糖水解酶的立体结构为基础，将位于具备由序列号1所示 的氨基酸序列的、来源于顶抱霉属（Acremonium)的纤维二糖水解酶的隧道结构内的30处 的氨基酸置换为丙氨酸，解析其活性，选择酶活性提高的位点。在30处的置换中，有6处与 野生型纤维二糖水解酶相比活性有所提高。
[0045] 通过丙氨酸置换，活性略