植物乳杆菌素plnE和plnF的异源表达方法
【技术领域】
[0001] 本发明书属于微生物工程技术领域，具体设及植物乳杆菌素 plnE和plnF的异源表 达方法。
【背景技术】
[0002] 化学防腐剂能有效抑制微生物生长，且成本低廉，但过量添加会对人体造成伤害， 随着人们对物质水平和饮食健康的需求不断增加，化学防腐剂愈来愈显现出自身的劣势。 此外，抗生素的滥用和耐药性等问题的出现，人们开始将目光转向具有安全、高效、无抗药 性、无残留和无污染等特点的细菌素上来。近几十年来，研究者已发现数百种乳酸菌细菌 素，却仍只有Nisin应用于食品行业，究其原因在于产细菌素的野生菌株产量低且分离困 难。由于Class II的乳酸菌细菌素相比较于Nisin具有抑菌谱广，使得国内外越来越多的研 究者致力于ClassII类乳酸菌素的研究开发，包括植物乳杆菌素 P1址和PlnF。然而，天然细 菌素所面临的最大挑战是纯化效率极低，近年来，利用异源表达提高细菌素产量的方法越 来越受到人们关注，已有多种细菌素实现其在大肠杆菌中的异源表达。植物乳杆菌素 PlnE/ F具有安全、抗菌活性强、抑菌谱广、热稳定和耐酸等优点，本研究拟通过植物乳杆菌素 P1址/F在大肠杆菌中的异源表达实现其高产，并对其抗菌活性和作用机制进行初步研究， W期为P1址/F在食品领域中的应用提供理论基础。
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种植物乳杆菌素 pi址和plnF的异源表达方法，通过探讨其作 用机制为W后在食品、医药卫生和饲料等领域的应用提供理论依据。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0005] 本发明的植物乳杆菌素 pi址和plnF的异源表达方法，包括下述步骤：
[0006] (1)从NCBI上查到pi址和plnF的基因序列，在切除前导肤序列后的pi址和plnF基 因序列的5 '端添加一个肠激酶位点，其基因序列为：5 ' -GATGATGATGATAAA-3 ' ；根据质粒 祀T-32a( + )的多克隆位点，选取两个酶切位点Κρη巧日Nco I，序列分别为5'-GGTACC-3'和 5'-圳〔646-3'，两端最后加入保护碱基，人工合成569 10齡.3所示的91址序列和569 10 No. 4序列所示的plnF序列；
[0007] (2)分别W质粒pUC57-pl址和pUC57-plnF为模板，PCR扩增pi址和plnF片段，分别 将纯化后的pi址和plnF的PCR产物和祀Τ-3^质粒进行50化体系双酶切，利用T4连接酶将酶 切纯化后的祀T-32a( + )线性质粒载体片段分别与PCR酶切回收产物pi址和plnF片段进行连 接，得到重组质粒祀T-32a-pl址和祀T-32a-plnF;
[000引 （3)重组质粒pET-32a-pl址和pET-32a-plnF转化入大肠杆菌工程菌E.coli BL21 (DE3)中，得到工程菌株化21 -pET-32a-p 1 址和化21 -pET-32a-pInF;
[0009] (4)分别挑取工程菌化21-pET-32a-pl址和化21-pET-32a-plnF单菌落在LB液体培 养基中，37°C培养过夜；按2%接种于含50yg/mL Ampr的LB液体培养基中，37°C摇菌培养至 0D600达到0.6;加 ImM IPTG进行诱导，200巧m的条件下诱导化。
[0010] 骤(2)中PCR引物如下：
[0011] pi址-S:5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3';
[0012] pi址-A:5'-CCGCTCGAGTTAACGAATACTTTTCA-3';
[0013] plnF-S:5'-CGCGGATCCGGTACCGATGA-3';
[0014] plnF-A:5'-CCGCTCGAGCTATCCGTGGA-3 \
[0015] PCR扩增反应体系为：10Xbuffer(Mg2+)化L，2.5mmol/L dNTP Mixture化L，10y mol/L上游引物2.5μL，10μmol/L下游引物2.5μL，模板2.5μL，PrimeSTARHSDNA Polymerase 0.扣L，其余为灭菌超纯水，总体积为50化;pi址PCR扩增反应条件为：95°C预 变性lOmin;进入循环，95°C变性25s，53°C退火25s，72°C延伸25s，30个循环;最后72°C延伸 lOmin，降溫至4°C保存;plnF PCR扩增反应条件为:95°C预变性lOmin;进入循环，95°C变性 25s，57.7°C退火25s，72°C延伸25s，30个循环；最后72°C延伸lOmin，降溫至4°C保存。
[0016] 所述pi址PCR产物双酶切反应体系为：10ΧΚ Buffe巧^，ρ1址PCR产物30^;Κρη 12. ，化0 12. ，d地2〇10yL，总体积50化；
[0017] 所述plnF PCR产物双酶切反应体系为：10ΧΚ Buffe巧化，plnF PCR产物30^;Κρη 12. ，化ο 12. ，d地2〇10yL，总体积50化；
[0018] 所述祀T-32a质粒双酶切反应体系为：10 X Κ Buf f e巧化，pET-32a质粒25化;Κρη 12.化L，化ο 12.化L，d地2〇 1扣L，总体积50化。
[0019] 所述plnE和plnF的连接反应体系为：酶切目的片段化L，酶切质粒1.5yL，10x T4DNAL igaseBuffer 化L，T4DNAL i gas eO.化L，总体积 1 OyL。
[0020] 细菌素(Bacteriocins)是一类由细菌核糖体合成，通过在祀细菌细胞膜上形成通 道或直接抑制祀细菌细胞内某些功能而高效发挥杀菌作用的抗菌肤或多肤类物质。与传统 抗生素相比，细菌素抗菌活性强，不易产生耐药性，且具有无毒副作用、无残留、不污染环境 等优点，近年来备受关注并有望成为解决耐药性问题的新一代抗菌剂。目前作用机制明确、 允许作为食品添加剂且已商业化的细菌素只有乳酸链球菌素(Nisin)-种，然而抑菌谱较 窄及抗性等问题大大降低了 Nisin在食品中的应用范围和应用效果。因此，开发新型细菌素 作为食品防腐剂或抗菌剂非常必要。与Nisin相比，Class II细菌素 P1址/F具有抗菌活性 强、抑菌谱广、热稳定、耐酸等优点，PlnE/F有望成为新一代食品防腐剂和抑菌剂。为克服天 然细菌素所面临的纯化效率极低运一困难，本研究利用大肠杆菌异源表达体系，构建表达 质粒并实现其在大肠杆菌的高效表达，使得大量制备PlnE/F成为可能，从而为其作用机理 研究及其今后在食品领域中的应用提供基础。
【附图说明】
[0021] 图1 pUC57-plnE和pUC57-plnF质粒的提取，注：注：Μ为Marker，1、2泳道分别为 pUC57-pl 址和 pUC57-plnF 质粒。
[0022] 图2合成基因 pi址和plnF片段的PCR扩增，注:Μ为Marker，1、3泳道分别为pi址和 plnF合成基因序列的PCR扩增产物，2、4泳道分别为pi址和plnF的阴性对照。
[0023] 图3重组质粒祀T-32a-pl址和祀T-32a-plnF的构建。
[0024] 图4质粒和目的片段粘性末端片段的获取，注:Μ为Marker,图A为祀T-3^i双酶切结 果，1为祀τ-3^ι质粒，2、3为Κρη I和化ο I双酶切后片段。图B为pi址和plnF的双酶切后纯化 的结果，其中1为pi址的双酶切产物纯化，2为plnF的双酶切产物纯化。
[0025] 图5菌液PCR结果，注:Μ为marker; A图中1-3为pi址菌液PCR，4为阴性对照，B图中2- 4为P InF菌液PCR，1为阴性对照。
[00%]图6 BL21-pET-32a-plnE和化21-pET-32a-plnF表达的SDS-PAGE分析，注：Μ为 marker;A图为化21-pET-32a-pl址诱导表达图，Β图为化21-pET-32a-plnF诱导表达图，1为 诱导后全菌体，2为诱导前全菌体。
[0027] 图7肠激酶酶切重组蛋白pET-32a-PlnF，注：Μ为Marker，1为重组蛋白pET-32a- PlnF，2-3 为 13°C 酶切产物，4 为PlnF。
[002引图8肠激酶酶切重组蛋白pET-32a-PlnE，注：Μ为Marker，1为重组蛋白pET-32a- P1址，2-8分别为4°C、13 °C、18 °C、23 °C、28 °C、33 °C、38 °C 酶切。
[0029] 图9 PI址、PlnF和PI址巧审菌活性。
【具体实施方式】
[0030] 1 材料
[00川 1.1菌种与质粒
[0032] 大肠杆菌E.coli D册α和大肠杆菌E.coli BL2UDE3)由本实验室保存。表达质粒 祀T-32a( + )购于生工生物工程(上海)有限公司，保存在大肠杆菌E.coli D册α中。
[0033] 1.2 试剂
[0034] 蛋白腺、酵母提取物、Ξ径甲基氨基甲烧(Tris)、氨节青霉素、过硫酸锭(APS)、异 丙基-β-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)、丙締酷胺、N，N-亚甲叉双丙締酷胺、SDS、漠酪蓝、 TEMED、考马斯亮蓝R-250、Tr i cine、琼脂糖、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、SDS-PAGE蛋 白标准均购自生工生物工程(上海)有限公司;daq酶、内切性限制酶化pn I，Nco I)、T4DNA Ligase、dNTPs、DNA Marker、质粒提取试剂盒购自TAKARA公司；DM凝胶回收试剂盒购自 AxyPrep公司；无水乙醇、甘油、冰乙酸、氨氧化钢、氯化钢等购自杭州邦易化工有限公司，均 为分析纯。
[0035] 1.3培养基与相关溶液配制
[0036] (1)LB培养基的配制
[0037] 1 )LB液体培养基：lOg蛋白腺，5g酵母膏，lOg化C1，超纯水定容至1000ml，调抑至 7.2，121°(：高压灭菌15111111。
[003引 2)LB固体培养基:在每lOOmL的LB液体培养基中添加1.5g琼脂粉，12TC高压灭菌 15min0
[0039] 3)含Ampr的LB固体培养基:待灭菌好的LB固体培养基冷却到50°C左右，加入Ampr 胆存液至终浓度50yg/mL，摇匀后倒入灭菌平