一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及金属硫蛋白的制备方法，特别是涉及一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。
【背景技术】
[0002]1957年，美国科学家Margoshoes在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出镉的金属蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量，能大量结合重金属离子，因此称为金属硫蛋白MT。金属硫蛋白MT可应用于包括医药、食品保健及化妆品添加剂、基因工程试剂、化学、环保、动物、农业等实验用品，前景十分广阔。
[0003]第一代MT制备是以兔为受体，通过免疫诱导获取MT，产率低，成本高；第二代MT制备原料以猪为主，金属硫蛋白产率比兔提升了 2-3倍，但还是远远不能满足需要，且占用场地大，污染严重等问题比较突出。寻求新的替代原料，实现经济、社会和环境效益的统一，势在必行。
[0004]目前国内外主要是通过以下方法来制备金属硫蛋白:(1)以硫酸锌诱导动物，以其肝组织为原料进行MTs提取，这种方法的优点在于利用人体所需的微量元素Zn，但其生产成本昂贵；(2)通过重金属诱导微生物获得MTs，利用第二种方法获得的类金属硫蛋白成本比动物诱导(即第一种方法)的要低，但由于培养基物质复杂，操作难度高。
[0005]海洋微藻个体较小，光合速率高，具有丰富的生物多样性，在自然海域中随处可见。全球海洋的总初级生产力绝大部分由海洋浮游微藻产生，因此海洋微藻又被誉为“海洋牧草”。海洋微藻代谢产物丰富多样，能够通过生物转化或后加工形成多种形式的生物产品。海洋微藻养殖不与人争粮，不与粮争地，是实现可持续发展及经济、社会和环境效益统一的最佳选择之一。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。该制备方法包括小球藻养殖筛选、金属离子诱导以及分离提纯。通过该方法制得的金属硫蛋白纯度更高，可吸附水体中的重金属离子，减少了对环境的污染，环境友好，更能满足保健、化工行业的生产需求。
[0007]本发明解决所述技术问题的技术方案是，提供一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征是该制备方法的具体步骤是:
[0008](I)将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h,然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h ;然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次；
[0009](2)利用0.03?0.lmol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的步骤(I)中的小球藻，培养 24-120h ；
[0010](3)利用0.03?0.lmol/L的CuCl2诱导处于步骤⑵处理后的小球藻，培养24-120h ；
[0011](4)根据步骤(2)和步骤(3)确定的最佳ZnCl2和CuCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，分离藻细胞，按藻细胞干重和PH值为7.8的Tris-HCl缓冲液以1:10?15 (w/v)的比例混合，混匀后进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
[0012](5)上清液过层析柱G-75，收集类金属硫蛋白粗提物；
[0013](6)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到基于小球藻的金属硫蛋白制品。
[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:本发明采用自养-异养交替方式培养小球藻，使小球藻的繁殖速率较其他培养方式高30%以上，且该方式培养的小球藻中叶绿素、类胡萝卜素以及蛋白含量均高于单一方式培养的小球藻；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg ；同时纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0016]本发明基于小球藻的金属硫蛋白制备方法(简称制备方法)，其特征在于该制备方法的具体步骤是:
[0017](I)将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h,然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h ;然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次；
[0018](2)利用0.03?0.lmol/L的ZnCl2诱导处于对数生长期的步骤(I)中的小球藻，培养 24-120h ；
[0019](3)利用0.03?0.lmol/L的CuCl2诱导处于步骤⑵处理后的小球藻，培养24-120h ；
[0020](4)根据步骤(2)和步骤(3)确定的最佳ZnCl2和CuCl2胁迫浓度和胁迫时间，大量培养小球藻，分离藻细胞，按藻细胞干重和PH值为7.8的Tris-HCl缓冲液以1:10?15 (w/v)的比例混合，混匀后进行超声波细胞破碎，经高速离心弃去沉淀，收集上清液；
[0021](5)上清液过层析柱G-75，收集类金属硫蛋白粗提物；
[0022](6)获得的类金属硫蛋白粗提物用超纯水复溶后，过层析柱G-25进行脱盐，再次真空冷冻干燥后即得到基于小球藻的金属硫蛋白制品。
[0023]本发明制备方法的进一步特征在于所述最佳ZnCl2胁迫浓度为0.05-0.06mol/L和最佳诱导时间为70-80h。
[0024]本发明制备方法的进一步特征在于所述最佳CuCl2胁迫浓度为0.04-0.05mol/L和最佳诱导时间为80-90h。
[0025]本发明采用自养-异养交替方式培养小球藻，使小球藻的繁殖速率较其他培养方式高30%以上，且该方式培养的小球藻中叶绿素、类胡萝卜素以及蛋白含量均高于单一方式培养的小球藻；采用锌、铜交替胁迫诱导制备金属硫蛋白，得到金属硫蛋白的产率高达10g/250kg;同时通过层析纯化后可得到更高纯度的金属硫蛋白。
[0026]本发明采用海洋小球藻代替动物细胞作为诱导产生金属硫蛋白的基质，小球藻既可以降解去除有机污染物和铵氮等含氮化合物，同时可以吸附去除水中的重金属，这在废水处理和保证水生生态系统的平衡与稳定方面都可以作为一种非常好的生物材料发挥重要作用。提取金属硫蛋白后的小球藻，可正常供饲料、保健品等行业所用，无废弃污染物，减少了动物细胞提取硫蛋白后对环境造成的污染。
[0027]实施例1
[0028]本实施例中本发明制备方法的具体步骤是:
[0029]I)将培养液置于反应器内，120°C下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25°C光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25°C无光照的培养箱中，培养5h ;重复此步骤3-10次；
[0030]2)在步骤I)中处于对数生长期的小球藻藻液中加入0.05mol/L氯化锌，控制锌在藻液中的最终浓度为5-100ymol/L范围内，继续培养小球藻24_120h，培养过程中每天定时手工摇瓶5次,每次约3min。取培养组小球藻藻液各10mL,经10000r/min离心，收集藻细胞，分别用5mmol/LEDTA-2Na和超纯